O-GlcNAc糖基化修饰NONO蛋白调控旁斑组装并促进结肠癌细胞增殖的机制研究

本研究针对NONO蛋白O-GlcNAc糖基化修饰在肿瘤发生中的作用机制不明的问题，通过质谱鉴定Thr440为关键修饰位点，揭示其通过调控旁斑（paraspeckle）组装影响微管组织相关基因表达和I型干扰素应答，最终促进结肠癌细胞增殖。该发现为靶向O-GlcNAc-NONO轴的癌症治疗提供新策略。

　　

在肿瘤生物学领域，蛋白质翻译后修饰如何调控癌细胞增殖始终是研究热点。O-连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）修饰作为一种营养敏感的修饰方式，其异常升高与多种癌症相关，但具体分子机制尚未完全阐明。与此同时，核内无膜细胞器旁斑（paraspeckle）由DBHS蛋白家族（包括NONO、SFPQ和PSPC1）与NEAT1₂长链非编码RNA共同组成，已被发现参与肿瘤进展，但其组装调控机制与代谢信号的联系仍是未解之谜。

这项发表在《Cell Death Discovery》的研究由国内团队完成，首次揭示NONO蛋白的O-GlcNAc修饰通过Thr440位点调控旁斑组装，进而影响结肠癌细胞增殖的双重分子开关机制。研究人员采用质谱鉴定、基因编辑、RNA测序和体内外功能实验等多学科技术，不仅填补了O-GlcNAc修饰调控核内凝聚体形成的知识空白，更为靶向癌症代谢-表观调控网络提供了新靶点。

关键技术方法包括：质谱鉴定NONO O-GlcNAc修饰位点；CRISPR-Cas9构建NONO敲除及回补的HCT116结肠癌细胞系；免疫共沉淀分析蛋白互作；RNA免疫沉淀（RIP）检测NEAT1₂结合；RNA测序分析差异基因表达；裸鼠异种移植模型评估肿瘤生长。

O-GlcNAc状态动态调控NONO旁斑样结构形成
通过小鼠肝脏组织和多种癌细胞模型，研究发现低葡萄糖条件或OGT（O-GlcNAc转移酶）敲低会减少NONO阳性核斑数量，而OGT过表达或OGA（O-GlcNAc水解酶）抑制剂Thiamet-G处理可逆转此现象。核质分离实验证实这种调控独立于NONO的亚细胞定位，提示O-GlcNAc修饰特异性影响旁斑组装。

Thr440是NONO的主要O-GlcNAc修饰位点
质谱分析和点突变实验锁定Thr440为关键修饰位点。进化保守性分析显示该位点在哺乳动物中高度保守，FLAG-NONO T440A突变体的O-GlcNAc信号显著减弱，但仍保留部分修饰，提示存在次要位点。

Thr440修饰介导旁斑核心组分互作
免疫共沉淀显示OGT抑制或敲低会削弱NONO与SFPQ/PSPC1的相互作用。在NONO敲除细胞中，回补野生型（WT）比T440A突变体能形成更多旁斑样结构，并更有效募集NEAT1₂ lncRNA。这表明O-GlcNAc修饰通过促进"NONO-NEAT1₂-DBHS蛋白"三元复合物形成来稳定旁斑架构。

转录调控的双向开关机制
RNA测序发现NONO缺失导致"微管细胞骨架组织相关基因"（如CENPF、NUF2）下调，而"I型干扰素应答基因"（如ISG15、MX1）上调。回补实验证实WT NONO能维持促增殖基因表达并抑制抑癌通路，而T440A突变体丧失此功能。值得注意的是，SFPQ敲低或OGT抑制均不可被NONO过表达挽救，证实O-GlcNAc修饰是旁斑功能的核心调控者。

Thr440修饰驱动肿瘤恶性表型
功能实验显示T440A突变体细胞的增殖、侵袭和软琼脂成瘤能力显著弱于WT组。裸鼠实验中WT组肿瘤体积/重量较突变体组增加2-3倍，证实O-GlcNAc-NONO轴在体内促瘤作用。

这项研究首次阐明O-GlcNAc修饰通过Thr440调控NONO的分子功能，提出"代谢感应-旁斑组装-转录重编程"的级联调控模型。其重要意义在于：1）揭示营养信号通过蛋白质修饰调控核内凝聚体的新机制；2）发现NONO协调促增殖与免疫逃逸的双重转录程序；3）提出靶向Thr440 O-GlcNAc修饰的结肠癌治疗策略。未来研究可进一步探索其他DBHS蛋白（如SFPQ）是否受类似修饰调控，以及该通路在肿瘤微环境中的免疫调控作用。