CRISPRi-dCas12a 系统助力蓝藻高效生产异丁醇和 3 - 甲基 - 1 - 丁醇：突破与创新

为解决蓝藻生产异丁醇（IB）和 3 - 甲基 - 1 - 丁醇（3M1B）产量低的问题，研究人员开展 dCas12a 介导的 CRISPR 干扰（CRISPRi-dCas12a）系统研究。结果显示该系统可提升产量，为代谢工程研究奠定基础。

　　在全球能源需求日益增长，环境问题愈发严峻的当下，生物基化学品和燃料的生产备受关注。蓝藻，作为一种神奇的光合原核生物，拥有利用阳光和二氧化碳进行光合作用的独特能力，被视作绿色细胞工厂的潜力股，在生产各类化学品方面展现出巨大潜力。其中，异丁醇（IB）用途广泛，可作为汽油的潜在替代品，在众多行业都有重要应用；3 - 甲基 - 1 - 丁醇（3M1B）则是优质的汽油添加剂和化学合成前体。

然而，目前利用蓝藻生产 IB 和 3M1B 的过程并不顺利。尽管已有研究对蓝藻进行了代谢工程改造，如通过传统策略提升产量，对关键酶进行修饰等，但产量仍不尽人意。传统的基于同源重组的策略还面临着诸多挑战，比如蓝藻的多倍体特性使得后续培养实现完全分离耗时漫长。在这样的困境下，开发新的技术手段来提高蓝藻中 IB 和 3M1B 的产量迫在眉睫。

为了攻克这些难题，来自瑞典乌普萨拉大学（Uppsala University）的研究人员展开了深入研究。他们致力于开发一种 dCas12a 介导的 CRISPR 干扰（CRISPRi-dCas12a）系统，并探索其在提升蓝藻中 IB 和 3M1B 产量方面的潜力。研究取得了令人瞩目的成果，成功构建的 CRISPRi-dCas12a 系统能有效抑制相关基因表达，显著提高了 IB 和 3M1B 的产量，为蓝藻代谢工程研究开辟了新道路。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上，为该领域的发展提供了重要参考。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：

• 构建菌株：通过自然转化的双同源重组构建 IB 和 3M1B 生产的基础菌株 HX11，并利用三亲交配法将靶向特定基因的 CRISPRi 质粒导入相应菌株12。
• 培养与检测：对不同菌株进行培养，通过测量光密度（OD₇₅₀）评估细胞生长情况；采用气相色谱（GC）技术对 IB 和 3M1B 进行提取和定量分析；运用实时定量 PCR（RT-qPCR）检测基因表达水平345。

下面来详细看看研究结果：

• CRISPRi-dCas12a 系统的设计与表征：从 Francisella novicida 中获取 Cas12a，将其改造为 dCas12a，构建了受鼠李糖诱导型启动子调控的 pBB_dCas12a 载体。研究发现，3 - 5mM 的鼠李糖可实现对靶基因的高效下调，但过高浓度的鼠李糖反而会降低下调效果。此外，起始细胞密度和诱导时间也会影响该系统对靶基因的下调效率，且不同靶基因的下调模式存在差异678。
• dCas12a 蛋白表达对蓝藻生产的影响：构建含有两个 kivd^S286T拷贝的菌株 HX11 作为生产 IB 和 3M1B 的基础菌株。实验表明，在鼠李糖诱导型启动子调控下，表达的 dCas12a 蛋白对细胞生长和 IB/3M1B 生产影响较小，证实了 CRISPRi-dCas12a 系统可用于探索不同基因靶点以提高产量910。
• 选择靶基因进行抑制：设计 crRNAs 靶向 15 个参与核心代谢途径的候选基因，这些基因编码的酶可能会限制 IB/3M1B 生产的前体供应。例如，选择蔗糖磷酸合酶（Sps）和果糖 1,6 - 二磷酸酶（Fbp）是因为它们参与蔗糖代谢，会使碳通量从丙酮酸转移；选择磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Ppc）、柠檬酸合酶（GltA）等 TCA 循环中的关键酶，旨在增强丙酮酸池11。
• CRISPRi-dCas12a 系统在生产菌株中的应用与验证：以 ppc、cpcB 和 ppsA 为优先靶基因进行抑制，结果显示抑制 ppc 基因表达可显著提高 3M1B 产量，证明了该系统在蓝藻中与异源 2 - 酮酸途径结合用于生产 IB 和 3M1B 的可行性1213。
• 应用条件优化：系统分析了鼠李糖诱导时间点、诱导浓度和 HCl 滴定对 CRISPRi-dCas12a 系统的影响。结果表明，鼠李糖在第 0 天添加、浓度在 1 - 10mM 时，有利于实现最佳基因抑制和 IB/3M1B 生产；HCl 滴定虽对相对 IB/3M1B 产量影响较小，但在特定时间段可提高产量141516。
• 系统应用该系统提高产量：构建 15 个靶向不同基因的菌株，结果发现 15 个靶基因中有 10 个对 IB 和 / 或 3M1B 生产有显著正向影响。如单基因抑制 ppc 可使 IB 产量提高 1.8 倍，3M1B 产量提高 8.6 倍；gltA 抑制后，IB 和 3M1B 产量分别提高 2.1 倍和 5.7 倍。同时，研究还发现该系统的有效性具有靶基因依赖性171819。
• 多重基因抑制提高产量：利用 CRISPRi-dCas12a 系统同时靶向多个基因。例如，构建同时抑制 ppc 和 gltA 的菌株 HX106，其 IB 和 3M1B 产量显著提高；构建含有多个原间隔序列的 crRNA 阵列，发现同时抑制多个利用中心碳代谢物作为底物的竞争反应，可进一步提高 IB/3M1B 产量，但组合多个有益 crRNA 并不总是能产生预期的协同增产效果2021。

研究结论和讨论部分指出，本研究成功设计了 dCas12a 组合多重抑制系统，优化培养条件后，抑制 10 个候选基因可显著提高 IB/3M1B 产量，其中 gltA 和 ppc 的单独下调效果尤为突出。同时，利用单个 crRNA 阵列同时抑制 4 个基因可产生协同效应。该研究为系统微调蓝藻代谢途径以提高 IB/3M1B 产量提供了新方法，也凸显了 dCas12a 在推进蓝藻生物技术应用方面的巨大潜力。不过，对于菌株代谢变化的深入机制，还需进一步通过代谢组学等分析手段进行探究。