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CRISPR-Cas9 基因编辑极具治疗潜力，但递送效率低限制其应用。研究人员探索 ARRDC1 介导的微泡（ARMMs）递送 CRISPR-Cas9 的潜能。结果显示 ARMMs 可高效递送，显著降低神经元中致病淀粉样肽。这为基因治疗带来新希望。
在基因治疗的前沿领域，CRISPR-Cas9 技术宛如一颗璀璨的新星，为攻克各种人类疑难病症带来了前所未有的希望。它能够像一把精准的 “基因剪刀”，对基因进行精确的修饰，无论是修正致病的基因突变，还是插入治疗性基因，又或是删除有害的基因序列，都不在话下。比如在治疗镰状细胞贫血和 β- 地中海贫血时，CRISPR-Cas9 就像一位技艺高超的 “基因修复师”，重新激活胎儿血红蛋白的生成，弥补成人血红蛋白的缺陷，为这些疾病的治愈开辟了新途径；在癌症治疗的战场上，经过 CRISPR 编辑的 T 细胞摇身一变成为了勇猛的 “抗癌战士”，增强了识别和摧毁癌细胞的能力。然而，这把 “基因剪刀” 在实际应用中却遇到了重重阻碍。其中，如何将 CRISPR-Cas9 高效地递送到目标细胞，成为了横亘在科学家面前的一座大山。现有的递送方法，像病毒载体虽然能靶向特定组织，但它的 “载货量” 有限，无法携带更多的基因元件；脂质纳米颗粒虽然能包裹较大的基因载荷，却可能对细胞产生毒性，引发炎症反应；电穿孔技术在体外应用时效果不错，可它就像一把 “双刃剑”，在导入 CRISPR 组件的同时，也会对细胞造成严重的损伤；核糖核蛋白（RNP）复合物虽然能减少脱靶效应和免疫反应，可在体内递送时却因效率和稳定性问题而举步维艰。
面对这些困境，科研人员们没有放弃，他们不断探索新的解决方案。在这样的背景下，来自未知研究机构的研究人员开展了一项旨在探索新型 CRISPR-Cas9 递送平台的研究。他们将目光聚焦在了一种名为 ARRDC1 介导的微泡（ARMMs，一种在细胞膜形成的细胞外囊泡）上，试图利用它来包装和递送 CRISPR-Cas9 复合物。研究人员通过一系列巧妙的实验设计和技术手段，最终发现 ARMMs 能够有效地将 CRISPR-Cas9 复合物递送到细胞内，并且在多种细胞类型中展现出了强大的基因编辑能力。这一研究成果发表在《Extracellular Vesicle》上，为基因治疗领域带来了新的曙光。
研究人员在开展这项研究时，运用了多个关键技术方法。首先是细胞培养技术，培养了包括 HEK293T 细胞、U2OS-gfp 细胞、ReNcell? CX 人类神经祖细胞系和人类诱导多能干细胞衍生的谷氨酸能神经元（iPSC-GlutaNeurons）等多种细胞。其次是基因编辑技术，构建靶向 eGFP 和人类 APP 的单导向 RNA（sgRNA）并导入相关载体。此外，还运用了蛋白质分析技术，如免疫印迹分析检测相关蛋白；以及基因测序技术，像 Sanger 测序和深度测序分析基因编辑情况 。
下面来看具体的研究结果：
- CRISPR-Cas9 复合物的包装：研究人员构建了两种融合构建体，将 ARRDC1 连接到 Cas9 的 N 端，一种是带有全长 ARRDC1 的 A1-Cas9，另一种是带有截短版本 ARRDC1（仅保留囊泡出芽所需的基本结构域）的 sA1-Cas9。实验结果令人惊喜，这两种融合构建体都保留了与未修饰 Cas9 相当的基因编辑活性，而且通过纳米颗粒跟踪分析和蛋白质免疫印迹分析发现，它们都能促进 Cas9 包装进入 ARMMs，其中 sA1-Cas9 的包装效率更胜一筹。
- VSV-G 假型化的 ARMMs 包装 CRISPR-Cas9：研究人员尝试用 VSV-G 对 ARMMs 进行假型化处理，以进一步提高其包装和递送效率。他们发现，随着 VSV-G 浓度的增加，细胞外囊泡（EVs）的出芽数量呈现出剂量依赖性的增加，而且 Cas9 的包装效率也显著提高。在优化 VSV-G 浓度后，sA1-Cas9 与 5% VSV-G 的组合实现了最高的包装效率，每个囊泡中大约能包装 1000 个 Cas9 分子。
- ARMMs 在 U2OS 细胞中递送 CRISPR-Cas9：研究人员将包装有 Cas9/sgRNA 复合物且靶向 GFP 基因的 ARMMs 与含有单个 GFP 基因拷贝的 U2OS 细胞共同孵育。通过检测 GFP 表达的变化来衡量基因敲除效率，结果发现，与未处理的对照组相比，孵育后 GFP 阴性细胞显著增加。特别是当使用 5% VSV-G 进行假型化处理时，sA1-Cas9 的编辑效率更高。同时，Western blotting、T7E1 分析和直接 DNA 测序都证实了 ARMMs 能够成功将 Cas9 递送到受体细胞并实现基因编辑。
- 通过 ARMMs 递送在人类神经元细胞中进行基因编辑：研究人员以人类神经元细胞为研究对象，选择了与神经退行性疾病密切相关的 APP 基因为靶点。他们用包装有 Cas9/sgRNA 的 ARMMs 孵育人类神经祖细胞 ReNcell CX 和人类 iPSC 衍生的神经元，通过多种检测方法发现，ARMMs 能够有效地递送到这些细胞中，实现高效的基因编辑，并且显著降低了淀粉样 β 肽（Aβ40 和 Aβ42）的浓度。同时，研究还发现 ARMMs 介导的基因编辑在预测的脱靶位点未观察到编辑现象，表明其具有较好的特异性。
综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。它首次证实了 ARMMs 可以作为一种高效的 CRISPR-Cas9 递送平台，通过直接将 ARRDC1 与 Cas9 融合，简化了传统的递送系统，提高了包装效率。截短版本的 ARRDC1 进一步增强了囊泡出芽和包装效率，而 VSV-G 假型化处理则显著提升了 Cas9 的包装和递送能力。在人类神经元细胞中对 APP 基因的成功编辑，为神经退行性疾病的治疗提供了新的策略和希望。虽然目前研究还存在一些局限性，如需要进一步在体内评估其效率和安全性，明确 VSV-G 增强 Cas9 包装的机制以及优化针对不同基因靶点的引导 RNA 等，但这无疑为基因治疗领域的发展奠定了坚实的基础，开启了新的研究方向。
