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在法医体液鉴定领域，传统方法存在诸多局限，mRNA 检测法虽有优势但也有不足。研究人员对比 RT-LAMP+CRISPR-Cas12a 与两种 mRNA 检测法。结果显示 RT-qPCR 综合性能最佳，RT-LAMP+CRISPR-Cas12a 特异性高但灵敏度有限。该研究为法医体液鉴定提供参考。
在法医科学中，体液证据分析对于确定犯罪现场样本的细胞来源至关重要，尤其是在性侵犯案件里，明确体液来源能帮助还原案件经过。然而，传统的体液分析方法存在特异性差、样本消耗量大等问题，难以满足司法实践的需求。随着科技发展，基于信使核糖核酸（mRNA）的检测方法应运而生，它能检测更多种类的体液，特异性和灵敏度更高，样本消耗也少。但这种方法也有弊端，需要昂贵仪器、反应时间长且不便于携带。为了找到更高效、便捷的体液鉴定方法，来自国外的研究人员开展了一项重要研究。该研究成果发表在《Forensic Science International: Genetics》上，为法医体液鉴定领域带来了新的思路和方向。
研究人员用到的主要关键技术方法包括：样本收集，从志愿者处收集多种体液样本（如外周血、唾液等），并进行处理和保存；RNA 提取，采用特定试剂盒和方法从样本中提取并纯化 RNA；检测分析，运用终点逆转录聚合酶链反应（endpoint RT-PCR，即 CellTyper 2）、实时逆转录定量 PCR（RT-qPCR）以及逆转录环介导等温扩增结合成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白 12a（RT-LAMP+CRISPR-Cas12a）技术对样本进行检测分析。
研究结果
- 单组分样本检测结果
- RT-LAMP+CRISPR-Cas12a：该方法对部分体液检测效果有限，如未优化出针对外周血和唾液的 mRNA 标记。但在检测阴道液中的 CYP2B7P 和月经血中的 MMP3 时，灵敏度较高，可检测到 1:10000 的稀释样本。不过，除 MMP3 外，其他标记区分目标和非目标体液的能力较弱，整体灵敏度低（22% - 58%），但特异性高（90% - 100%）。
- Endpoint RT-PCR：CellTyper 2 对多数标记灵敏度较好，但特异性欠佳。存在过度扩增现象，在多种体液样本中出现非特异性扩增，尤其是在直肠黏膜样本中，多种标记出现交叉反应。不过，其标记的预测价值较高，AUC 值为 0.70（CYP2B7P） - 0.89（TNP1 和 MMP10）。
- RT-qPCR：相比其他两种方法，RT-qPCR 对多数标记灵敏度更高，除外周血中的 SLC4A1 外。在多数体液样本中特异性达到 100%，在检测唾液、阴道液和月经血等样本时，比其他方法更灵敏，标记的预测价值也高，AUC 值为 0.75（SLC4A1 和 KLK2） - 0.92（STC1）。
- 体液混合物检测结果
- RT-LAMP+CRISPR-Cas12a：在检测体液混合物时，部分标记表达不稳定，如 KLK2。CYP2B7P 在部分混合物中检测结果有偏差，整体性能受样本混合物影响情况不明，需更多实验评估。
- Endpoint RT-PCR：能正确识别部分混合物，但存在过度扩增和标记表达不稳定问题，在混合物中标记表达变异性大，可能影响检测特异性。
- RT-qPCR：所有测试的混合物都能被正确识别，标记表达稳定，但在阴道液和直肠黏膜混合物中，KLK2 检测的变异性较大。
- 成本和样本处理时间：CellTyper 2 最耗时，运行时间 323 分钟，操作时间长；RT-qPCR 最快，运行时间 60 分钟，操作时间 10 分钟；RT-LAMP+CRISPR-Cas12a 操作时间 15 分钟，但总运行时间 90 分钟。成本方面，RT-LAMP+CRISPR-Cas12a 最便宜，RT-qPCR 最贵。
研究结论和讨论
研究表明，目前的 endpoint RT-PCR（CellTyper 2）虽有一定灵敏度，但存在诸多问题，尤其是在检测直肠黏膜样本时，交叉反应严重，需要开发特定标记以提高特异性。在刑事调查中，检测的特异性至关重要，因为假阳性结果可能导致误判。RT-LAMP+CRISPR-Cas12a 特异性高，但灵敏度和精度有待提升，需优化引物和反应条件，或寻找替代标记来提高检测效果。RT-qPCR 综合性能最佳，灵敏度和特异性高，能精确区分混合物成分，但也需进一步研究更有效的阴道液和直肠黏膜标记。RT-LAMP+CRISPR-Cas12a 因其快速、低成本的特点，有望作为初步筛查工具，与 RT-qPCR 等方法结合，可提高性侵犯案件样本分析效率，助力司法公正。不过，该研究样本量较小，捐赠者群体不够多样化，未来需扩大样本规模，研究不同人群的标记表达差异，以完善法医体液鉴定技术。
