构建多模态筛选平台：解锁 C9orf72 相关神经疾病治疗新钥匙

本文构建了用于检测 C9orf72 患者诱导多能干细胞（iPSC）神经元中内源性二肽重复蛋白（DPRs）的多模态筛选平台。通过该平台发现了调控 DPRs 的小分子和基因，为肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等疾病研究提供新思路。

　　

研究背景

短串联重复序列的扩增与多种神经退行性和神经肌肉疾病相关，如肌萎缩侧索硬化（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）等。C9orf72 基因内含子 1 中的 G₄C₂六核苷酸重复扩增是 ALS 和 FTD 最常见的遗传病因，通过重复相关非 AUG（RAN）翻译产生的二肽重复蛋白（DPRs）在中枢神经系统组织中积累，具有神经毒性。目前对 DPRs 的研究存在诸多挑战，如现有遗传筛选研究未在 DPRs 的内源性环境中进行，患者来源的 iPSC 神经元中内源性 DPRs 检测困难，限制了高通量筛选。因此，开发在 iPSC 神经元中对 C9orf72 DPRs 进行高通量筛选的方法至关重要。

研究方法

1. 构建 C9orf72 患者 i³N DPReporter 细胞系：利用 CRISPR - Cas9 技术，将编码荧光报告基因 NLS - mApple 和强力霉素诱导型神经生成素 2（NGN2）的表达盒整合到携带约 700 个重复的患者细胞系的 CLYBL 安全港位点，构建 C9orf72 患者 i³N 亲代细胞系。之后，将 HiBiT 标签插入到 i³N 患者细胞系中 GGGGCC 重复扩增下游的 polyGA 或 polyGP 阅读框中，生成 “DPReporter” 细胞系。
2. 高通量小分子筛选：优化培养条件和 384 孔板格式的发光检测，用 C9orf72 反义寡核苷酸（ASO）处理确认检测 DPR - HiBiT 水平的可靠性，优化荧光毒性检测与荧光素酶检测的多重检测。用核苷类似物地西他滨处理验证报告细胞系检测 DPR 调节剂的能力，对包含 1444 种化合物的天然产物文库进行高通量筛选。
3. 研究小分子 Periplocin 对 DPR 周转的影响：开发活细胞内源性 DPRs 的活标记方案，通过 HiBiT 发光跟踪其降解。研究 Periplocin 对未折叠蛋白反应（UPR）和 ERK1/2、AMPK 激活的影响，用 MEK1/2 抑制剂曲美替尼预处理细胞，观察对 DPR 水平的影响，并在 C9orf72 果蝇模型中验证。
4. CRISPRn 筛选人类解旋酶：进行包含所有 95 种人类解旋酶和 58 种含解旋酶结构域基因的 CRISPR - Cas9 敲除（CRISPRn）筛选，优化实验条件，用 3 个引导 RNA 和重组 SpCas9 蛋白转染 i³N GA - HiBiT 细胞，进行成像和发光 / 毒性检测，确定影响 DPR 表达的基因。

研究结果

1. C9orf72 患者 i³N DPReporter 细胞系的特性：DPReporter 细胞系能灵敏、快速地检测裂解细胞和活细胞中的内源性 DPRs，其发光信号比未标记的亲代细胞系高 20 - 130 倍，且信号特异性得到验证。对细胞系进行详细分析，包括 C9orf72 sense 和 antisense 重复 RNA 焦点、antisense RNA 转录本、多能性标记物的表达，以及基因组完整性、重复长度等检测，确定 i³N GA - HiBiT 细胞系适合用于筛选。
2. 高通量小分子筛选结果：筛选确定了 25 种降低 DPR 水平和 31 种增加 DPR 水平且无毒性的化合物，72 小时和 120 小时处理的筛选结果相关性高（r² = 0.78，p < 0.0001）。确定 Periplocin 为内源性 polyGA 和 polyGP 水平的增强剂，其能浓度依赖性地增加 DPR 水平，且在未编辑的患者 iPSC 衍生细胞系中得到验证。
3. Periplocin 的作用机制：Periplocin 抑制 DPR 周转（t_1/2DMSO = 36 h，t_1/2periplocin > 96 h），可能通过激活 ERK1/2 通路增加 DPR 水平。在 C9orf72 果蝇模型中，曲美替尼处理可降低 ERK 磷酸化和 polyGP 水平，延长果蝇寿命。
4. CRISPRn 筛选结果：CRISPRn 筛选确定了 15 种敲除后降低 polyGA - HiBiT 水平的基因，其中 5 种基因（ERCC8、RECQL、RECQL4、RTEL1 和 UPF1）对全局翻译无影响，具有增强的对 RAN 翻译的特异性。STRING 分析和文献挖掘发现，4 种解旋酶（RECQL、RECQL4、RTEL1 和 UPF1）与端粒稳态和维持功能相关，且敲低这些解旋酶可降低 DPR 水平。

研究结论

本研究建立了基于荧光素酶的高通量筛选方法，可用于研究 iPSC 衍生神经元中内源性 C9orf72 DPR 水平的调节剂。HiBiT 标签的使用有助于在其他重复扩增疾病中研究内源性 RAN 翻译蛋白。发现 Periplocin 可调节 DPR 表达，其作用机制与 ERK1/2 激活有关，且在果蝇模型中得到验证，为 C9FTD/ALS 的治疗提供了潜在的药物靶点。CRISPRn 筛选确定了端粒相关解旋酶可调节 DPR 表达，揭示了端粒和 C9orf72 重复序列调控的重叠性。但研究存在局限性，如无法确定 HiBiT 标记的 DPRs 是否为纯的，也不能立即区分 DPR 与 RNA 的毒性。未来可进一步研究这些问题，为相关疾病的治疗提供更多思路。