抗癌新契机：BiDAC 依赖的内溶酶体系统降解质膜蛋白

在癌症治疗研究中，为探究双功能降解激活化合物（BiDACs）诱导质膜受体酪氨酸激酶（RTKs）降解的机制，研究人员用形态学分析和 CRISPR/Cas9 基因筛选技术展开研究，发现 BiDACs 可使 RTKs 转运至溶酶体降解，这为相关药物研发提供新思路。

　　

在生命科学和医学领域，细胞内的信号传导就像一场精密的 “交响乐”，一旦出现混乱，疾病就可能乘虚而入。其中，受体酪氨酸激酶（RTK）在细胞增殖等过程中扮演着极为重要的角色，其异常表达或激活与多种癌症的发生、发展紧密相关。以往，研究人员对阻断 RTK 依赖的信号传导下游后果进行了深入探究，但对于双功能降解激活化合物（BiDACs）依赖的 RTK 降解影响却知之甚少。

BiDACs 作为一类新型药物，能够促进其蛋白质靶标的清除，为攻克癌症等疾病带来了新希望。然而，目前人们并不清楚 BiDACs 如何诱导不同类型靶蛋白的降解，尤其是质膜和细胞器内的蛋白。因此，开展对 BiDACs 诱导质膜 RTK 降解机制的研究显得尤为迫切，这对于开发更有效的癌症治疗策略具有重要意义。

为了解开这些谜团，来自 Calico Life Sciences LLC 等机构的研究人员开展了一项深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先是形态学分析（morphological profiling），该技术利用高通量显微镜和基于机器学习的图像分析，能够建立代表细胞状态的形态学表型，以此来探索细胞扰动的后果。其次是 CRISPR/Cas9 基因筛选技术，研究人员通过构建全基因组 CRISPR 文库，感染表达 Cas9 的细胞，筛选出影响 BiDAC 诱导 RTK 降解的相关基因。此外，还利用了 Western blotting、免疫沉淀（immunoprecipitation）、显微镜成像（microscopy）和流式细胞术（flow cytometry）等技术，用于检测蛋白水平、分析蛋白间相互作用、观察细胞形态和量化细胞内分子变化。

下面来看看具体的研究结果：

• RTK BiDACs 的表征：研究人员使用了之前报道的 BiDAC（Lap - VHL）和新合成的 Her2 特异性 BiDAC（Tuc - VHL）。实验结果显示，这两种活性 BiDACs 能够以剂量和时间依赖的方式降解 Her2 和 EGFR（在 SKBR3 和 SKOV3 细胞系中），并且相较于无活性的 BiDACs，活性 BiDACs 能更有效地降低细胞活力、抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。这表明活性和无活性的 Her2 BiDACs 可用于对比 Her2 降解和抑制的不同后果。

• Her2 功能丧失与多种形态学表型相关：研究人员利用改良的细胞染色方案结合免疫荧光探针，对 Her2 功能丧失进行了无偏形态学分析。通过机器学习模型训练，将处理后的细胞图像在高维空间中表示，并进行聚类和可视化。结果发现，活性 BiDACs 处理的细胞形成了独特的聚类，且该聚类与 Her2 降解所需时间相关。去除 Her2 染色信息后，活性 BiDACs 聚类的独特性降低，这表明 Her2 水平和定位的变化是活性 BiDACs 诱导独特形态学表型的主要特征。

• 鉴定 BiDAC 诱导 RTK 降解所需的机制：研究人员采用功能基因组学方法，对表达 Cas9 和 GFP/RFP 敲入的 RTK 细胞（RTK - FP）进行全基因组 CRISPR 筛选。结果发现，未能降解 RTK - FP 的细胞中，靶向关键 E3 复合物成分（如 VHL、CUL2 等）、泛素相关酶（如 UBA1、UBE2R2）、NEDD8 激活和结合酶以及溶酶体 ATP 酶（V - ATPase）亚基的 sgRNAs 显著富集。这表明 BiDAC 诱导的 RTK 降解是由内溶酶体系统介导的。

• BiDAC 诱导的 RTK 降解需要功能性溶酶体和蛋白酶体：研究人员通过使用 V - ATPase 抑制剂（Bafilomycin - A1，Baf - A1）、E1 抑制剂（MLN - 7243）和蛋白酶体抑制剂（Carfilzomib）处理 RTK - FP 细胞，发现这些抑制剂均能阻断 RTK 降解。同时，显微镜成像显示 BiDACs 可触发 RTKs 转运至溶酶体，且蛋白酶体抑制会阻止 BiDAC 诱导的 RTK 内化，这可能是通过阻断 RTK 泛素化实现的。

• PQLC2 调节溶酶体对 EGFR - RFP 的降解：研究人员发现，靶向氨基酸转运体 PQLC2（由 SLC66A1 基因编码）的 sgRNAs 在未能降解 EGFR - RFP 的细胞中富集。敲除 PQLC2 会抑制 Lap - VHL 和 EGF 诱导的 EGFR - RFP 降解，但不影响 BiDAC 诱导的 RTK 内化。进一步研究表明，PQLC2 通过一种不依赖其已知生物学功能（如阳离子氨基酸转运和与 CSW 复合物结合）的机制调节 EGFR - RFP 降解，且 PQLC2 在溶酶体内会发生切割，其 C 末端片段足以挽救 EGFR - RFP 降解。

• PQLC2 在维持溶酶体 pH 中的作用：鉴于 PQLC2 与 V - ATPase 亚基的相互作用，研究人员探究了其对溶酶体 pH 的影响。通过构建表达 mScarlet - LAMP1 的 PQLC2 敲除细胞（PQLC2^KO?pH），研究发现敲除 PQLC2 会导致溶酶体 pH 升高、体积增大，且影响溶酶体对 LC3 的降解。而重新表达 PQLC2（包括野生型和突变体）能够恢复溶酶体 pH 和大小，这表明维持溶酶体 pH 可能是 PQLC2 调节溶酶体底物（如 EGFR）降解的关键功能。

综合研究结论和讨论部分，这项研究具有重要意义。研究人员通过无偏形态学分析，比较了不同抑制方式对 Her2 的影响，发现 BiDACs 的更强效力可能源于对经典 Her2 信号的更持续抑制。同时，研究揭示了 BiDAC 介导的泛素化将 RTKs 靶向内溶酶体途径的机制，这与当前对 RTKs 泛素化和转运的认知不同，为进一步研究质膜蛋白的降解机制提供了新方向。此外，研究还发现 PQLC2 在调节溶酶体稳态和底物降解中的新功能，其对溶酶体 pH 的调节作用可能是维持溶酶体正常功能的关键。这些发现为开发基于 BiDACs 的新型癌症治疗药物提供了理论基础，有望推动癌症治疗领域的新突破。