活细胞中FUS蛋白动态互作组的时空解析：CLAPM技术揭示液-液相分离的蛋白质组学特征

本研究针对活细胞内液-液相分离(LLPS)动态蛋白质组解析的难题，开发了邻近标记辅助质谱技术(CLAPM)，成功捕捉了FUS蛋白在神经元细胞中形成的LLPS液滴内129-822个特异性蛋白，首次系统鉴定出596个LLPS原生蛋白、226个LLPS依赖蛋白和58个LLPS敏感蛋白，为神经退行性疾病(如ALS/FTD)的病理机制研究提供了新工具，相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

在细胞这个微观宇宙中，蛋白质分子通过神秘的"液-液相分离"(Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS)现象自发形成无膜细胞器，如同星云凝聚成恒星。这种生物分子组装过程调控着基因转录、应激反应等关键生命活动，更与肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)等神经退行性疾病密切相关。其中，RNA结合蛋白FUS的异常相分离会导致病理性蛋白聚集，但科学家们长期面临一个关键难题：如何在活细胞中实时捕捉这些瞬息万变的"蛋白质星云"？

传统研究方法如同用固定焦距的望远镜观察流星雨——体外模拟无法还原真实细胞环境，荧光标记又只能追踪少数蛋白质。特别是对于FUS这类低复杂度结构域(Low Complexity domains)蛋白，其弱相互作用、瞬时结合的动态特性更让研究举步维艰。邻近标记技术(Proximity labeling, PL)虽提供了新思路，但现有酶标记效率低、毒性大，且无法解决蛋白翻译过程中的扩散标记问题。

上海交通大学的研究团队在《Nature Communications》发表的研究中，开发了革命性的CLAPM技术(Composition of LLPS proteome Assembly by Proximity labeling-assisted Mass spectrometry)，首次实现了活细胞内LLPS过程的时空动态解析。该研究巧妙融合了抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)高效标记与化学标记策略，避开了光点击化学的假阳性干扰，在神经元细胞中成功绘制出FUS互作组的"星云图谱"。

关键技术包括：构建FUS-APEX2-EGFP融合蛋白系统；优化钠砷酸盐诱导的LLPS条件；开发基于15N/14C标记的SILAC定量蛋白质组学；建立五组对照实验体系区分三类动态蛋白质组；应用STRING数据库构建蛋白质相互作用网络；通过APP/PS1和SOD1转基因小鼠模型验证新发现的LLPS蛋白。

研究团队首先证实FUS-APEX2-EGFP融合蛋白在10 mM NaCl条件下能形成可逆的LLPS液滴，通过荧光漂白恢复(FRAP)实验显示液滴内FUS流动性保持70%恢复率。在神经元细胞中，他们观察到钠砷酸盐刺激30分钟后液滴达到最大半径，共聚焦显微镜证实链霉亲和素标记的蛋白质精确定位于液滴内部。

通过八种条件对比实验，研究人员在HeLa、HEK 293T和神经元细胞中分别鉴定出129、182和822个LLPS特异性蛋白。其中神经元细胞展现出最复杂的蛋白质组成，包括596个LLPS原生蛋白、226个LLPS依赖蛋白和58个LLPS敏感蛋白。这些蛋白质形成密集的相互作用网络(PIN)，涉及RNA加工、热休克反应调控等通路。特别值得注意的是，64.3%的邻近标记蛋白属于LLPS依赖型，提示相分离过程显著重塑了FUS的互作景观。

在FUS P525L突变体模型中，研究揭示了CDC20、FDXP1等11个新型LLPS蛋白与神经退行性疾病的关联。这些蛋白在APP/PS1小鼠脑组织中呈现4-16倍的表达差异，且普遍具有高比例的内在无序区(IDR)和低复杂度结构域，与LLPS形成机制高度吻合。通过整合五个公共数据库，研究人员发现CLAPM能额外覆盖65%的已知LLPS蛋白，其中EIF4B、SPTBN2等蛋白在神经退行病变中扮演关键角色。

这项研究的意义不仅在于开发了CLAPM这项"分子显微镜"，更在于揭示了LLPS过程的动态本质——蛋白质互作网络如同交响乐谱，LLPS原生蛋白构成基础旋律，LLPS依赖蛋白加入形成和声，而LLPS敏感蛋白则像转调音符，共同演绎细胞生命的动态平衡。该发现为理解神经退行疾病的分子机制提供了新视角，特别是热休克蛋白(HSP)通路与LLPS清除的关联，提示蛋白质质量控制(PQC)系统失调可能是疾病发生的共同通路。

未来，CLAPM技术可进一步优化酶催化效率，用于解析P-body、应激颗粒等LLPS亚型的分子架构，或在精子发生等特殊生物学过程中探索相分离的奥秘。这项研究如同绘制了一幅"细胞宇宙"的星图，为探索生命微观世界的相变规律提供了全新坐标。