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神经元蜡样脂褐质沉积症（NCLs）中的 CLN5 病，目前缺乏有效治疗手段。研究人员构建 cln5 基因敲除斑马鱼模型开展研究，发现 CLN5 缺陷影响葡萄糖代谢，确定 PHGDH 为潜在生物标志物，二甲双胍可改善相关症状，为疾病治疗提供方向。
在神秘的大脑疾病领域，神经元蜡样脂褐质沉积症（NCLs，也被称为巴顿病）是一类令人棘手的神经代谢溶酶体贮积症。它们如同隐藏在孩子成长路上的 “恶魔”，是儿童期起病的神经退行性疾病中最常见的类型，也是欧洲儿童痴呆的主要病因。CLN5 病作为 NCLs 中的一种超罕见晚婴儿型变体，更是给患者和家属带来了沉重的负担。由于目前对 CLN5 相关细胞机制了解有限，缺乏明确的药物靶点，针对这类疾病的治疗大多只能缓解症状，无法从根本上解决问题。因此，探索 CLN5 功能缺失对发育的影响，寻找相关通路和生物标志物，成为攻克青少年痴呆的关键所在。
为了揭开 CLN5 病的神秘面纱，来自意大利 IRCCS Fondazione Stella Maris 的 Neurobiology and Molecular Medicine Unit 等多个研究机构的研究人员踏上了探索之旅。他们构建了一种全新的 cln5 基因敲除斑马鱼模型，并对其进行了深入研究。最终发现，CLN5 功能缺失不仅影响了视网膜 ON - 双极细胞的轴突生长和小脑的钙稳态，还揭示了葡萄糖代谢受损这一此前未被发现的特征。此外，他们还确定了 PHGDH（磷酸甘油酸脱氢酶）作为一种新的生物标志物，并验证了二甲双胍在改善患者来源细胞中 PHGDH 表达和拯救斑马鱼行为方面的作用。这些发现为开发针对青少年痴呆的靶向治疗提供了有前景的方向，相关研究成果发表在《Molecular Psychiatry》上。
研究人员在本次研究中主要运用了以下几种关键技术方法：首先是基因编辑技术 CRISPR/Cas9，用于构建 cln5 基因敲除斑马鱼模型；其次是多组学技术，包括 RNA 测序（RNA - seq）和蛋白质组学分析，以此探究基因和蛋白质表达的变化；另外，还运用了多种细胞和分子生物学实验技术，如定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blotting）、免疫组化染色等，来分析基因和蛋白的表达水平、细胞的生理变化等。同时，研究使用了斑马鱼和人类皮肤成纤维细胞样本，其中斑马鱼模型通过特定的饲养和繁殖获得，人类样本则来自于 CLNet 网络招募的患者和健康对照。
研究结果
- 新型 cln5 斑马鱼品系的生成和表征：研究人员评估了 cln5 在斑马鱼发育过程中的时空表达。原位杂交显示，5 dpf（受精后天数）时 cln5 mRNA 在整个幼虫身体表达，在大脑水平表达最高，且从发育第一阶段就开始表达。利用 CRISPR/Cas9 系统成功编辑出 cln5-/-斑马鱼模型，导致外显子 2 发生 2 - bp 缺失和错义突变，产生移码突变和提前终止密码子。qRT - PCR 和质谱分析证实了 cln5 基因表达降低和 BMP（双（单酰甘油）磷酸）合成减少。突变体在形态上表现为 5 dpf 幼虫体长和卵黄囊面积略有增加，并且重现了 NCL 疾病的主要病理特征，如线粒体 ATP 合酶亚基 C 积累、大脑细胞凋亡增加、脂质积累，同时伴有行为改变，包括幼虫和成年突变体运动能力下降、视网膜功能受损、神经元兴奋性增加以及钙稳态受损等。
- 转录组分析提示脂质和葡萄糖代谢可能受损：RNA - seq 分析显示，与野生型相比，cln5-/-幼虫中有 76 个基因上调，101 个基因下调 。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析表明，突变体中差异表达基因（DEGs）大多与细胞凋亡、视觉功能和细胞周期相关，而下调的通路主要与葡萄糖代谢有关，如胰岛素生长因子（IGF）转运和摄取的调节、糖酵解和糖异生等。同时，脂质代谢也发生了改变，斑马鱼幼虫大脑中脂质积累，BMP 脂质合成减少。
- 不同发育阶段 cln5-/-突变斑马鱼的蛋白质组分析：不同发育阶段（6 hpf 胚胎和成年鱼的大脑和眼睛）的蛋白质组分析显示，cln5-/-样本与野生型相比有多个差异表达蛋白（DEPs）。IPA 分析支持 RNA - seq 结果，表明大脑和眼睛中的脂质代谢和葡萄糖代谢均发生改变。葡萄糖摄取实验进一步证实了 cln5-/-幼虫葡萄糖摄取显著减少，从功能上验证了转录组和蛋白质组数据。
- 鉴定与不同 NCLs 形式相关的新型跨物种生物标志物：通过对成年和胚胎样本中 DEPs 的分析，发现 PHGDH 在所有样本中均过表达。蛋白质免疫印迹在斑马鱼幼虫和成年大脑样本中证实了这一点，并在携带 CLN5 突变的人类细胞以及携带 CLN7 突变的患者细胞中得到验证。
- 二甲双胍治疗拯救人类成纤维细胞中 PHGDH 的表达和斑马鱼的行为缺陷：用二甲双胍处理 CLN5 患者来源的人类成纤维细胞，能够恢复 PHGDH 的表达。对斑马鱼胚胎的处理也证实了二甲双胍对突变胚胎卷曲行为缺陷的拯救作用。
研究结论与讨论
本研究构建的斑马鱼 cln5-/-模型成功重现了 CLN5 病的主要特征，为研究疾病的神经退行性进展提供了有力工具。研究揭示了 CLN5 在钙稳态中的潜在作用，其功能缺失导致大脑钙稳态受损，可能驱动神经退行性变和细胞应激。同时，模型中还重现了自噬缺陷，这可能是导致神经退行性变和认知能力下降的原因之一，提示针对自噬的治疗可能是减缓疾病进展的有前景策略。
多组学研究发现了葡萄糖代谢的改变，这与 CLN5 功能缺失首次建立关联，胰岛素生长因子 1（IGF1）相关通路可能成为潜在药物靶点。此外，确定 PHGDH 为生物标志物具有重要意义，它在不同 NCLs 患者细胞中均有表达差异，可能通过影响丝氨酸和甘氨酸水平、脂质代谢以及神经递质合成等，参与 NCLs 的神经退行性过程。二甲双胍对 PHGDH 表达的调节作用，显示出其在治疗 CLN5 缺陷相关疾病中的潜在价值，但具体分子机制仍有待进一步研究。
总之，本研究为深入理解 CLN5 病的发病机制提供了新视角，确定的生物标志物和潜在治疗药物为开发针对 NCLs 的靶向治疗策略奠定了基础，有望为青少年痴呆的治疗带来新的突破。
