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创伤性脑损伤（TBI）危害大且治疗困难。研究人员通过 RNA-seq 和 WGCNA 等技术，分析 TBI 后小鼠脑组织分子病理变化。发现炎症、神经元恢复、髓鞘再生等进程的变化规律，为 TBI 治疗提供新方向。
创伤性脑损伤（Traumatic Brain Injury，TBI），这个隐匿在生活暗处的健康杀手，时刻威胁着人们的生命与生活质量。每年，全球有 5000 万到 6000 万例 TBI 发生，仅美国在 2014 年就有 253 万人因 TBI 紧急就医。TBI 不仅在急性期夺命，还会在后续漫长的日子里，让患者饱受运动、情感障碍之苦，记忆力减退、注意力不集中等认知问题频发，甚至大大增加患痴呆症的风险，给家庭和医疗系统带来沉重负担。
当前，TBI 的治疗面临着重重困境。原发性损伤往往瞬间发生且难以逆转，治疗主要聚焦于减轻继发性损伤、促进神经修复与再生。然而，TBI 后的病理生理过程极为复杂，炎症反应、细胞死亡、血脑屏障破坏、白质变性等继发性损伤机制与轴突再生、突触重塑等内源性修复机制相互交织，且随时间动态变化。但目前，对这些关键病理生理变化的时间进程，仍缺乏系统研究。为了打破这一困境，中国 - 日本友好医院的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了一项深入研究，旨在揭示 TBI 后分子病理变化的奥秘。研究成果发表在《Experimental Neurology》杂志上，为 TBI 的治疗带来了新的曙光。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，构建 TBI 小鼠模型，将 C57BL/6 雄性小鼠分为 11 组，包括假手术组和不同时间点的损伤组。接着，对小鼠脑组织进行 RNA 提取和测序，获取基因表达数据。随后，利用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）构建基因共表达网络，识别关键模块。还借助 STRING 数据库和 Cytoscape 软件筛选枢纽基因，并运用 Mfuzz 方法进行验证。此外，通过单细胞 RNA 测序、定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）等技术对相关基因进行验证分析。
下面来看看具体的研究结果：
- WGCNA 分析确定关键模块的时间模式：通过 RNA 测序对 11 个时间点的 33 个样本分析，经 WGCNA 聚类得到 14 个基因模块。其中蓝色、绿黄色、绿色、蓝绿色和黄色模块表达随时间呈现不同规律变化。如蓝色模块表达逐渐下降，蓝绿色模块先升后降，黄色模块持续上升。
- 关键模块的功能富集分析：对上述五个关键模块进行功能富集分析，发现蓝色模块与突触形成相关，绿黄色模块参与炎症和免疫调节，绿色模块涉及白细胞迁移和免疫反应，蓝绿色模块与细胞增殖和免疫调节有关，黄色模块主要参与神经胶质生成和髓鞘形成。Nissl 染色和免疫荧光结果也证实了相关结论，如 Nissl 染色显示损伤早期尼氏体数量减少，3 - 7 天后逐渐增加；GFAP 免疫荧光染色表明 7 天后星形胶质细胞活化增强。此外，将绿黄色、绿色和蓝绿色模块定义为神经炎症相关模块（NIRMs），Iba1 染色显示 3 - 7 天小胶质细胞大量浸润，反映炎症激活和继发性损伤过程。
- Mfuzz 分析基因表达和功能动态变化：Mfuzz 分析将基因分为 10 个簇，其中 2、4、6、9、10 簇变化明显。功能富集分析发现，6 簇与神经胶质生成等相关，4 和 10 簇与突触功能和认知有关，2 和 9 簇参与免疫反应和细胞增殖调节。同时，差异表达分析和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）表明，不同时间点细胞迁移、炎症、白细胞增殖、神经元突触可塑性、神经胶质生成等功能通路分别被激活或抑制。
- 确定关键模块的枢纽基因：利用 STRING 数据库和 Cytoscape 软件确定各模块枢纽基因。如蓝色模块的 Dlg4、Grin1 等与突触功能有关；绿黄色模块的 Jun、Fos 等参与炎症反应；绿色模块的 Icam1、Il1β 等在免疫细胞迁移和炎症中起作用；蓝绿色模块的 Casp3、Tlr4 等与细胞凋亡和免疫反应相关；黄色模块的 Mog、Plp1 等与神经胶质细胞再生和髓鞘形成有关。RT-qPCR 验证结果与模块时间表达模式相符。
- 单细胞测序数据集验证：利用单细胞 RNA 测序数据验证枢纽基因表达。将细胞分为 9 个谱系，发现不同细胞类型中枢纽基因表达存在差异。如 Dlg4、Grin1 在神经元中表达较高，Jun、Fos 等在小胶质细胞中表达为主，Mog、Plp1 在少突胶质细胞中高表达。且 7 天 TBI 组与假手术组相比，部分基因表达有差异，进一步证实 WGCNA 分析结果。
- TBI 后焦亡基因的表达：焦亡是一种炎性程序性细胞死亡过程，研究发现绿黄色、绿色和蓝绿色模块与焦亡相关基因集有交集。绿色和蓝绿色模块包含焦亡关键基因，绿黄色模块含有炎症因子。RT-qPCR 和 WB 分析表明，非经典焦亡途径可能比经典途径更早激活，Casp11 表达先于 Casp1。
在研究结论和讨论部分，研究人员通过 RNA 测序结合 WGCNA 分析，揭示了 TBI 后小鼠大脑转录组的时间变化。发现炎症在 6 - 3 天达到高峰，神经元恢复过程在 7 天尚未开始，而髓鞘再生和胶质形成在 7 天高度活跃。这一研究成果意义重大，WGCNA 分析为研究疾病进展过程中转录组变化的时间动态提供了有效方法，让人们对 TBI 后的病理生理过程有了更深入的理解，为未来开发针对 TBI 不同阶段的精准治疗策略奠定了基础，有望改善 TBI 患者的预后，减轻家庭和社会的负担。
