优化CRISPR/Cas9系统提升解脂耶氏酵母基因编辑效率的研究

研究人员针对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因编辑效率低的问题，通过优化sgRNA表达启动子(如SCR1-tRNA)、构建tRNA-sgRNA架构、删除KU70基因及过表达Rad52/Sae2等策略，将基因破坏效率提升至92.5%，双基因编辑效率达57.5%，并开发出高效整合的iCas9D147Y, P411T突变体。该研究为微生物细胞工厂构建提供了强大工具，发表于《Engineering Microbiology》。

　　

基因编辑技术CRISPR/Cas9（规律间隔成簇短回文重复序列关联蛋白9）近年来在合成生物学领域掀起革命，但在非传统酵母如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中仍面临效率瓶颈。这种产油酵母因其强大的代谢能力和酸性耐受性，被广泛用于有机酸、萜类和脂类生产，但低效的同源重组修复(Homologous Recombination, HR)和高度活跃的非同源末端连接(Non-Homologous End Joining, NHEJ)通路严重限制了精确编辑。更棘手的是，现有研究中sgRNA表达策略、Cas9蛋白稳定性及DNA修复调控等因素的影响尚未系统评估，导致不同实验条件下的编辑效率波动显著。

为攻克这些难题，国内研究团队在《Engineering Microbiology》发表了一项突破性研究。他们发现采用RNA聚合酶III(Pol III)启动子SCR1驱动tRNA嵌合sgRNA表达时，URA3基因破坏效率飙升至92.5%，远超传统Pol II启动子55%的效率。这种设计巧妙利用酵母内源tRNA加工系统，使sgRNA成熟效率倍增。更令人振奋的是，通过tRNA-sgRNA串联架构首次在解脂耶氏酵母中实现TRP1/URA3双基因57.5%的同步破坏效率。

在基因组整合优化方面，研究揭示了KU70基因（NHEJ通路关键因子）缺失可使同源介导的GFP整合效率跃升至92.5%，而过表达酿酒酵母来源的ScRad52（HR促进因子）可进一步增效20%。尤为关键的是，团队引入的iCas9^{D147Y, P411T}突变体通过电荷优化和构象调整，使质粒表达系统的基因整合效率提升至75%，解决了传统Cas9质粒不稳定的痛点。

技术方法上，研究采用PO1f-Cas9工程菌株为底盘，通过Gibson组装构建质粒，锂乙酸法转化酵母。编辑效率通过SC缺陷培养基筛选和PCR验证，关键比较包括：不同启动子(sgRNA表达)、Cas9基因组整合vs质粒表达、KU70缺失/Rad52过表达(修复通路调控)、以及iCas9突变体测试。

研究结果可分为五大发现：

1. sgRNA表达优化：SCR1-tRNA组合使Pol III转录效率超越传统核酶加工的Pol II系统，单基因编辑效率达92.5%（图1B-C）。
2. 孵育时间影响：转化后4天液体培养使编辑效率最大化至82.5%，提示Cas9蛋白需要累积时间（图2B）。
3. 多基因编辑突破：tRNA-sgRNA架构实现双基因57.5%同步破坏，但质粒表达Cas9时效率骤降至10%（图3B-E）。
4. 修复通路调控：KU70缺失使HR效率提升至92.5%，而ScRad52过表达比YlRad52效果更显著（图4C-E）。
5. iCas9突变体优势：D147Y/P411T突变使质粒系统单基因编辑效率达100%，整合效率提升32.5%（图5A-D）。

这项研究的核心突破在于建立了针对解脂耶氏酵母的"三位一体"优化方案：通过SCR1-tRNA实现sgRNA高效表达，KU70缺失/ScRad52过表达调控修复通路平衡，再结合iCas9突变体增强切割特异性。这不仅解决了该酵母HR效率低、NHEJ活跃的固有难题，更首次系统比较了基因组整合与质粒表达Cas9的适用场景。研究者特别指出，质粒表达的iCas9虽便于快速操作，但基因组整合Cas9在多重编辑和DNA整合中仍具不可替代的优势。

该成果对构建解脂耶氏酵母细胞工厂具有里程碑意义。高效的基因编辑能力可加速生产菌株开发，例如同步敲除多个竞争途径基因或精准整合异源合成模块。研究中发现的ScRad52比内源YlRad52更有效这一现象，也为其他真菌的CRISPR优化提供了新思路。未来，结合新型Cas变体和修复通路工程，这套系统有望成为非传统酵母遗传改造的金标准。