综述：农产品中生物风险因子的检测技术及其应用

这篇综述聚焦农产品生物风险因子检测技术。详细阐述了细菌、真菌、病毒和寄生虫等风险因子的危害，介绍了核酸扩增（如 PCR、LAMP 等）、免疫分析、生物传感器等检测技术，分析了面临的挑战并展望前景，为相关研究提供了全面参考。

　　

1. 引言

农产品作为人类生存和发展的基本战略资源，如谷物、蔬菜、水果和肉类等，为人们提供了必要的营养，对保障全球食品安全至关重要。然而，农业生产正面临双重危机：一方面，预计到 2050 年全球人口将超 96 亿，对主要农作物的需求将增加 60%；另一方面，农产品在整个生产过程中，从种植、生长、收获到运输、储存，都面临着被细菌、真菌、病毒、寄生虫等生物风险因子污染的威胁。

这些致病微生物可通过作物 - 牲畜 - 人类的交叉传播链，导致作物减产、牲畜死亡，甚至引发严重的公共卫生危机。例如，2010 年，31 种食源性疾病致使全球 3300 万人受伤或残疾，其中 5 岁及以下儿童占食源性病例的 40%，沙门氏菌和诺如病毒造成了巨大的疾病负担。生物污染导致农产品供应受限，加上食源性疾病的激增，给全球食品安全和医疗保健系统带来了前所未有的压力。

为应对农业生物安全风险，生产者尝试采用技术创新和转变生产模式进行风险管理，如使用生物农药替代、优化养殖密度、部署智能监测系统等。但这些转变在成本平衡、技术适用性和生态可持续性方面面临诸多挑战。因此，早期识别生物风险因子并制定针对性策略更为现实。

目前，生物风险检测技术呈现经典与新兴技术并行的格局。经典方法如聚合酶链反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱 - 质谱联用（GC - MS）等虽准确性高，但所需设备和复杂的流程严重限制了现场检测的效率。而生物传感器、表面增强拉曼光谱（SERS）、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）等新兴方法则在检测速度（分钟级响应）、场景适应性（现场 / 实验室多场景兼容）和成本效益方面实现了突破，形成了新一代快速检测技术体系。值得注意的是，便携式设备（如手持拉曼光谱仪）的工程应用，使技术从实验室走向生产一线，开启了农产品生物风险监测的现场即时诊断时代。

2. 农产品中的主要生物风险因子

食源性病原体可借助农产品传播，当人们食用未经妥善处理的受污染食品时，病原体可通过食道进入人体，引发食物中毒、肠胃炎、人畜共患病感染、恶心、呕吐等疾病。

2.1. 细菌

代表性的食源性致病细菌包括大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、福氏志贺菌、蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌属等。2011 年，德国爆发的产志贺毒素大肠杆菌 O104:H4 疫情，仅两个月就导致 2971 例肠胃炎病例，其中 18 人死亡。在欧盟 2020 年人畜共患病报告中，确诊的人类病例中，弯曲杆菌病有 120946 例，沙门氏菌病有 52702 例，耶尔森菌病有 5668 例，产志贺毒素大肠杆菌病例有 4446 例。此外，定量风险模型显示，超 90% 的侵袭性李斯特菌病病例是由摄入每克含 2000 个菌落形成单位（CFU）单核细胞增生李斯特菌的 “肉类及肉制品”“鱼类及渔业产品” 和 “牛奶及奶制品” 引起的，植物源食品和冷冻食品也曾与单核细胞增生李斯特菌爆发有关。

2.2. 真菌

霉菌毒素如赤霉烯酮毒素、赭曲霉毒素 A、黄曲霉毒素 B₁（AFB₁）、伏马菌素 B₁和呕吐毒素等，是特定真菌在特定环境下产生的有毒小分子代谢物，常出现在玉米、小麦等作物中。它们可通过摄入、吸入进入人体和动物体内，直接接触皮肤也会造成危害。在津巴布韦 2016 - 2017 年，玉米在收获和储存期间黄曲霉毒素和伏马菌素的流行率高于谷物，食用受感染玉米可能导致肝细胞癌发病率高达 9.2/10 万人 / 年，给当地医疗系统带来沉重负担。

2.3. 病毒

病毒是一类无细胞结构的特殊生物，必须在宿主细胞内才能完成生命周期，离开宿主细胞后便失去活性。病毒给农业生产和发展造成了巨大损失，也引发了严重的公共卫生问题。例如，非洲猪瘟病毒（ASFV）可通过人员车辆在不同地区传播，导致猪患致死性疾病。2015 年，ASFV 致使近 100 万头家猪和 1300 头受感染的欧洲野猪死亡或被扑杀，给畜牧业带来巨大经济损失。人类诺如病毒是急性肠胃炎的主要病原体之一，2001 - 2015 年，在美国每年导致约 900 人死亡、10.9 万人住院、46.5 万次急诊就诊和 227 万次门诊就诊，每年的医疗负担达 6 亿美元，且病毒每年都在变异，增加了人类健康风险。

2.4. 寄生虫

寄生虫是一类利用宿主获取营养以生存和繁殖的致病性无脊椎动物和单细胞原生动物。常见的食源性寄生虫包括蒂氏隐孢子虫（C. tyzzeri）、棘口吸虫、线虫卵、猪结肠小袋纤毛虫和牛带绦虫等。血吸虫是一种食源性人畜共患寄生虫，其生命周期复杂，可通过农产品传播，进入人体后会引发肝脏组织损伤和炎症等问题。牛带绦虫每年造成的经济损失巨大，主要影响养牛户，在医疗设施欠发达地区，寄生虫问题常被忽视，但可能导致不可估量的损失。

3. 生物风险因子检测技术

准确检测农产品中的生物风险因子对构建有效的食品安全保护体系至关重要。近年来，随着检测技术的迭代升级，在灵敏度、检测限和动态范围等关键性能指标上取得了突破。针对不同生物风险因子的特异性，新型高效的检测技术不断涌现，如 CRISPR - Cas 系统凭借 “分子剪刀” 的高特异性重构了核酸检测的便携路径，SERS 技术利用纳米级 “热点” 效应在单分子水平上实现了复杂基质中痕量毒素的灵敏识别。同时，传统检测技术与前沿技术的融合，加速了其向小型化、模块化的发展。PCR 作为准确验证的 “金标准” 方法，抗体试剂盒用于现场即时筛查，生物传感器和质谱 / 光谱技术则分别在小型化集成和分子指纹分析方面拓展了检测场景，这些检测技术形成了多维互补的技术网络。

3.1. 核酸扩增技术

PCR 是一种分子生物学技术，可在体外快速扩增特定 DNA 片段。基于 PCR 衍生出了一系列新技术。

• qPCR：定量实时 PCR（qPCR）通过在 PCR 反应体系中添加荧光染料或基团，实时监测染料积累并利用 Ct 值和标准曲线进行定量分析，主要有 TaqMan 探针法和 SYBR Green I 染料法。例如，有研究建立了检测小麦中异皮线虫（Heterodera filipjevi）的 TaqMan qPCR 技术，该技术引物特异性良好，检测限（LOD）可达 4^–3个单条第二代幼虫（J2）DNA；还有研究利用 SYBR Green I 染色法检测生牛奶中的蜡样芽孢杆菌，优化退火温度后，检测限为 200 CFU/mL，定量限（LOQ）为 2×10² - 2×10⁸ CFU/mL。此外，通过使用叠氮溴化丙锭（PMA）可消除死细胞导致的假阳性，提高检测准确性，如应用 PMA - qPCR 检测燕窝、驴皮胶和枸杞中的沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，检测限分别为 100、100 和 10 CFU/mL。
• RT-PCR：逆转录 PCR（RT - PCR）利用模板 RNA 逆转录合成互补 cDNA 进行 PCR 分析，广泛用于检测病原菌。如比较 RT - PCR 和双抗体夹心 ELISA（DAS - ELISA）检测辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）的性能，RT - PCR 仅需一粒种子即可检测到目标病毒，且在评估病毒垂直传播率时比视觉观察更可靠。还有研究开发了多重 RT - PCR 技术，可同时检测百合中的多种病毒。
• RT-qPCR：实时定量荧光逆转录 PCR（RT - qPCR）先将模板 mRNA 或总 RNA 逆转录成 cDNA，再进行 qPCR 定量分析。该技术可用于检测多种农产品中的微生物病原体，如检测番茄和辣椒作物中的番茄褐色皱纹果病毒（ToBRFV）、葡萄中的葡萄藤 E 病毒（GVE）、草莓和蔬菜中的诺如病毒和甲型肝炎病毒等。此外，RT - qPCR 还可用于分析食品中的寄生虫，如检测克氏锥虫（Trypanosoma cruzi），并能区分活寄生虫和非活寄生虫。
• dPCR：数字 PCR（dPCR）是一种高度灵敏的核酸绝对定量方法，将反应体系均匀分配到独立反应单元进行 PCR 扩增，根据泊松分布计算核酸拷贝数。如使用 dPCR 检测鸡肉冲洗液中的沙门氏菌属，检测限为 0.001 ng/μL，定量限为 0.01 ng/μL；还有研究对比了优化的 RT - dPCR 方法和符合 ISO 15216 标准的 RT - qPCR 方法检测牡蛎组织中诺如病毒 GI 和 GII 的效果，发现 RT - dPCR 检测诺如病毒 GI 的变异系数更低。

LAMP 是一种等温核酸扩增技术，利用具有高链交换活性的 DNA 聚合酶和一组特殊设计的引物在等温条件下扩增目标 DNA 链，在病原微生物检测中应用前景广阔。

• 传统 LAMP：有研究建立了检测草莓中尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum f. sp. Fragariae）的 LAMP 技术，检测限为 100 pg 基因组 DNA；还有研究建立了检测比目鱼中奇努克鲑鱼巴芬病毒（CSBV）的 LAMP 技术，检测限低至 10 pg/μL。此外，LAMP 技术还可用于检测马铃薯中的球茎线虫（Spongospora subterranea）、油菜中的大茎点菌（Leptosphaeria biglobosa）、向日葵中的麦克唐纳茎点霉（Phoma macdonaldii）、大豆中的茶褐斑球腔菌（Calonectria ilicicola）、橄榄植物中的理查兹侧口线虫（Pleurostoma richardsiae）和有毒蘑菇中的硬皮马勃（Hebeloma crustuliniforme）等，且部分方法检测结果可肉眼观察。
• RT-LAMP：逆转录 LAMP（RT - LAMP）将逆转录与传统 LAMP 系统相结合，提高了核酸扩增能力。如建立了检测猪鼻样本中甲型流感病毒（IAV - S）的 RT - LAMP 方法，检测限为 20 M 基因拷贝（直接 LAMP 检测基质基因标准）；还有研究开发了检测柑橘黄龙病病原菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）的快速 RT - LAMP 方法，检测灵敏度低至 2.6 Log10 拷贝；此外，RT - LAMP 技术还可用于检测大麦黄花叶病毒（BaYMV）、玉米黄花叶病毒（MaYMV）、香蕉苞片花叶病毒（Banana Bract Mosaic Virus）和甲型肝炎病毒等。

等温重组酶聚合酶扩增（RPA）基于 T4 噬菌体核酸复制机制，通过单链结合蛋白、重组酶蛋白和 DNA 聚合酶的作用实现恒温核酸扩增。如建立了检测虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei）的实时 RPA 检测系统，比传统凝胶电泳 RPA 技术灵敏度高 60 倍，检测限为 13 个基因拷贝 / 反应；还有研究建立了 RPA 与侧向流动距离（RPA - LFD）相结合的方法，用于快速检测志贺氏菌和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC），检测限为 1.29×10²拷贝 /μL。此外，RPA 还可用于同时检测不同病原菌，如同时检测金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌、玉米褪绿斑驳病毒和甘蔗花叶病毒等，以及检测非洲猪瘟病毒（ASFV），检测限为 10²拷贝 /μL。

3.2. 免疫分析技术

免疫分析技术利用超微检测和抗原 / 抗体反应，将自然免疫反应与现代检测技术相结合，用于评估农产品的质量和安全，常见的免疫分析技术包括 ELISA、胶体金免疫层析（GICA）和时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）等。

• ELISA：ELISA 有直接、间接、夹心和阻断等多种变体。如建立了间接 ELISA 方法检测猪链球菌（Streptococcus suis），该方法可检测 2、7 和 9 型猪链球菌，且与其他菌无交叉反应；还有研究建立了多种检测非洲猪瘟病毒（ASFV）的间接 ELISA 技术，使用不同的抗原，检测灵敏度和特异性良好。此外，ELISA 还可用于检测猪圆环病毒（PCV）抗体、黄曲霉毒素 B₁（AFB₁）等，竞争 ELISA 也可用于检测 ASFV，阻断 ELISA 可用于检测 ASFV 的 p72 蛋白。
• GICA：胶体金免疫层析（GICA）是一种新兴的体外诊断技术，利用胶体金作为标记物，可实现快速检测。如建立了基于 GICA 的血吸虫病快速检测方法，使用新型皂苷蛋白 SjSAP4，检测效果良好且稳定性高；还有研究建立了检测山羊支原体肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae，Mccp）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、弓形虫（T. gondii）、猪圆环病毒 2 型（PCV2）和小麦、玉米中的伏马菌素 B₁（FB₁）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）等的 GICA 方法，这些方法具有检测速度快、操作简便等优点，但也存在通量不高、易出现假阳性或假阴性结果等缺点。
• TRFIA：时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）利用镧系元素及其相应的螯合剂作为抗体或抗原标记物，通过测量荧光强度来定量分析物质含量。如开发了基于 TRFIA 的玉米和饲料中 AFB 检测方法，检测限低，检测过程仅需 21 分钟；还有研究建立了检测 ASFV 抗原、金黄色葡萄球菌、DON 等的 TRFIA 方法，部分方法还开发了检测试纸条，具有较高的灵敏度和特异性。

3.3. 生物传感器技术

生物传感器能将目标物质的浓度转化为电信号进行检测，由生物分子识别元件和信号转换器组成，具有稳定性高、灵敏度高和选择性好等优点，在食品安全监测领域应用广泛。

• 比色生物传感器：比色生物传感器通过测量样品与标准溶液的吸光度差异来定量分析样品中物质的含量。如开发了基于 AuNP 的比色生物传感器检测面粉中的大肠杆菌 O157:H7 DNA，检测限为 2.5 ng/μL；还有研究基于 CuSe 纳米颗粒开发了红外抑菌比色生物传感器检测牛奶中的大肠杆菌 O157:H7，检测限为 10³ CFU/mL。此外，利用噬菌体作为识别元件的比色生物传感器可检测金黄色葡萄球菌，还有基于纸基和离心管的比色生物传感器，分别用于检测细菌和鼠伤寒沙门氏菌，提高了检测的灵敏度和便捷性。
• 电化学生物传感器：电化学生物传感器将生物识别与电化学信号转换相结合，可在复杂生物流体、食品样品甚至体内对特定分子进行连续、实时、快速的原位检测。如开发了基于芯片的可扩展电化学生物传感器检测水中的蒂氏隐孢子虫（C. tyzzeri），检测限为 20 cells/5 μL；还有研究基于金电极开发了检测鸡肉中沙门氏菌属的电化学免疫传感器，基于 MXene - 放大亚甲基蓝信号和静电固定噬菌体开发了检测牛奶和鸡蛋中活沙门氏菌的电化学生物传感器，检测限分别为 10 CFU/mL 和 5 CFU/mL。此外，还有基于 NaBiF4 上转换纳米颗粒（UCNPs）的电化学发光生物传感器检测大肠杆菌 O157:H7，以及基于 CuO₂@COF - NH₂纳米复合材料的双电化学 - 比色传感器检测诺如病毒等。
• 适配体生物传感器：适配体是一类新型生物识别分子，具有优异的识别能力和高稳定性。如基于适配体的荧光传感器可快速检测玉米中的 FB₁，检测限为 14.42