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本文聚焦 Retromer 复合物，阐述其在真核细胞和发育生物学中的核心地位，尤其是在人类神经保护方面的作用。文中探讨 Retromer 与辅助蛋白的相互作用，以及其在进化中 “权力分离” 现象，为理解相关疾病机制和治疗提供新思路。
引言
在人体中，大量的整合膜货物蛋白、相关蛋白和脂质在内体网络中流动。货物进入内体网络后面临两种命运抉择：一是被分选并运输到溶酶体进行降解，从而从细胞中清除；二是被回收再利用，这些货物会被运输到包括细胞表面、自噬和生物合成途径，以及在特殊细胞中的溶酶体相关细胞器中。这种命运抉择取决于内体限制膜上的两个不同纳米结构域：降解亚结构域和回收亚结构域。降解亚结构域主要由 ESCRT 蛋白富集和向内芽生的囊泡构成；而回收亚结构域的特征包括富含货物的管状 - 囊泡结构和簇，它们从限制膜延伸到细胞质，是运输回收货物进行再循环的载体；高度动态的分支丝状肌动蛋白网络，肌动蛋白过多或过少都会破坏亚结构域组织和货物回收；以及多个多蛋白复合物，如 Retriever、CCC 复合物、WASH 复合物、膜管化分选衔接蛋白（sorting nexin，SNX） - Bin/Amphiphysin/Rvs（BAR）蛋白和 Retromer 等。需要注意的是，WASH、Retriever 和 CCC 复合物在酵母中并不表达，这表明人类（和后生动物）回收亚结构域的组织和调控与酵母中的相应亚结构域存在根本差异。
酵母 Retromer - SNX - BAR 五聚体 —— 例外而非规则
Retromer 是由 Vps26、Vps35 和 Vps29 组成的异源三聚体，在酵母中，它与具有 BAR 结构域的 Vps5 和 Vps17 异源二聚体形成稳定的五聚体组装。Vps5:Vps17 异源二聚体能够促进管状 - 囊泡运输载体的生物发生，并通过高亲和力相互作用招募 Vps26:Vps35:Vps29 异源三聚体，稳定膜组装的五聚体复合物。Vps26:Vps35:Vps29 异源三聚体还负责选择整合蛋白进入回收和再循环途径。通过协调货物识别和运输载体生物发生过程，酵母 Retromer - SNX - BAR 五聚体复合物显示出包被复合物的特征。
目前，人们已经了解了 Vps5:Vps17 自组装和管状运输载体生物发生的机制，这些蛋白质具有膜重塑 BAR 结构域。同时，也开始理解 Vps26:Vps35:Vps29 异源三聚体识别序列依赖性整合蛋白的机制。一个关键突破是阐明了膜相关 Retromer 的结构，它由 Vps26:Vps35:Vps29 的二聚体拱组成，围绕膜近端的 Vps26:Vps35 碱基排列，膜远端的 Vps35:Vps29 区域构成单个拱顶部的二聚体界面。相邻的二聚体 Retromer 拱相互关联，形成与膜相关的 Vps5:Vps17 异源二聚体结合的松散伪螺旋阵列。
人类表达稳定的 VPS26:VPS35:VPS29 异源三聚体，在膜上形成类似的拱形结构。人类有两个 VPS26A 和 VPS26B 直系同源基因，以及至少三个 VPS29 直系同源物，但它们的功能意义大多尚不清楚。人类还表达 SNX1 和 SNX2 作为 Vps5 的直系同源物，SNX5 和 SNX6 作为 Vps17 的直系同源物（SNX6B，也称为 SNX32，在人类神经元中也有表达，为简单起见，统一用 “SNX6” 表示）。这些直系同源物遵循酵母 Vps5:Vps17 异源二聚体规则，即 SNX1 或 SNX2 与 SNX5 或 SNX6 组装。
酵母和后生动物还共享另一种 Retromer 组装形式，由 Vps26:Vps35:Vps29 异源三聚体与非 BAR 结构域的 SNX（酵母中的 Snx3p 和人类中的 SNX3）相关联。内体相关的 Snx3p/SNX3 通过 Vps26 与 SNX3 的界面识别序列依赖性货物，招募 Vps26:Vps35:Vps29。Vps26:Vps35:Vps29 也可以通过与酵母中的活性 Ypt7 和人类中的 RAB7 结合被招募到内体。货物识别促进内体结合和 SNX3 - Retromer 货物回收和再循环复合物的形成，通过 Retromer 拱的组装，形成松散的膜结合螺旋阵列，至少在体外能够驱动小管生物发生和包括铁转运蛋白 DMT1 - II 在内的货物分选。
Retromer 蓝图的演变
酵母 Retromer - SNX - BAR 五聚体复合物为人类和后生动物中相应蛋白质的初步分析提供了范例。酵母 Retromer - SNX - BAR 复合物通过两个核心相互作用组装：Vps26 直接与 Vps5 相互作用，Vps5 的内在无序氨基末端区域呈现出与 Vps29 和 Vps35 直接结合的二分序列，其中一个关键元素是 Vps5 中的 Pro - Leu（PL）基序，它与 Vps29 中的疏水凹槽结合，此外，Vps35 与 Vps5 中含 Leu - Phe 的序列相互作用，增强了相互作用的亲和力。
在人类中，虽然有一些证据表明 VPS26:VPS35:VPS29 与 SNX1/SNX2:SNX5/SNX6 异源二聚体之间存在直接相互作用，但大多数研究表明这种潜在相互作用充其量是低亲和力且高度短暂的。例如，冷冻电子断层扫描（cryo - ET）和对涂有 Vps5 和 Vps26:Vps35:Vps29 的膜小管的子断层扫描平均显示出稳定的 Retromer 拱，但人类 VPS26:VPS35:VPS29 异源三聚体无法与膜相关的 SNX1:SNX5 包被形成复合物。与此一致的是，SNX1 和 SNX2 的内在无序氨基末端区域缺乏在 Vps5 中通过与 Vps29 和 Vps35 结合来稳定五聚体 Retromer - SNX - BAR 组装的保守二分基序。对人类细胞内体分选的功能分析也表明，SNX1/SNX2:SNX5/SNX6 异源二聚体独立于 VPS26A/B:VPS35:VPS29 异源三聚体发挥作用。这些数据支持在人类中，VPS26A/B:VPS35:VPS29 异源三聚体和 SNX1/SNX2:SNX5/SNX6 异源二聚体已经演变成两个不同的复合物，不会形成稳定的五聚体关联（推测这在 Retromer 跨后生动物中是常见的）。为了表示这种根本差异，在人类（和后生动物）中，“Retromer” 一词指 VPS26A/B:VPS35:VPS29 异源三聚体，而 SNX1/SNX2:SNX5/SNX6 异源二聚体被称为 ESCPE - 1 复合物。那么，这种 “权力分离” 是如何发生的，为什么这种分离对于理解人类 Retromer 生物学如此重要呢？
VPS29—— 关键亚基
VPS29 是 Retromer 中最小的亚基，也是与相关 Retriever 复合物共享的唯一亚基。VPS29 包含两个高度保守的疏水表面，一个表面埋在与 VPS35α - 螺线管羧基末端部分的界面相互作用中，另一个在相反一侧，包含一个溶剂暴露的疏水凹槽。在酵母五聚体 Retromer 中，正是这个溶剂暴露的凹槽与 Vps5 中的 PL 基序结合，有助于五聚体复合物的组装。人类 Vps5 的直系同源物 SNX1 和 SNX2 中缺乏等效的 PL 基序，这部分解释了人类无法形成稳定的五聚体 Retromer 组装的分子原因。此外，这也解放了 VPS29 中溶剂暴露的 PL 结合位点，使其能够与一系列功能多样的蛋白质结合，包括 RAB7 GTP 酶激活蛋白（GTPase - activating protein，GAP）TBC1D5、RAB21 鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine - nucleotide exchange factor，GEF）VARP、肌动蛋白聚合 WASH 复合物的 FAM21 亚基、Retriever 的 VPS35L 亚基，以及 RAB10 GEFs DENND4A 和 DENND4C、RAB10 GAPs TBC1D1 和 TBC1D4、RAB32 GAP TBC1D13 等。所有这些辅助蛋白都具有与 VPS29 结合的 PL 基序，这些相互作用有助于它们被招募到 Retromer 内体回收亚结构域。
以 WASH 复合物的 FAM21 亚基为例，它包含一个广泛的 1100 个氨基酸的无序 “尾巴”，其中包含 21 个重复的 LFa 基序（Leu - Phe - 酸性残基）。在这些重复序列中，羧基末端的第 21 个重复序列独特地包含一个 PL 基序（1330IFDDPLNAF1338），它与 VPS29 中的疏水凹槽结合。另外两个 LFa 基序与 VPS35 羧基末端区域的两个保守位点结合，形成了 FAM21 和伴随的 WASH 复合物的三点结合机制。值得注意的是，虽然具体细节不同，但这些相互作用在许多方面模仿了酵母 Vps5 与 Retromer 的二分相互作用。在人类中，RAB GAPs TBC1D5、TBC1D1/D4 和 TBC1D13，以及 RAB GEFs VARP 和 DENND4A/4C 通过其 PL 基序与 VPS29 结合，并通过额外的二级关联，在 Retromer 驱动下被招募到内体，限制局部 RAB7 激活，可能还包括 RAB10、RAB21 和 RAB35 的激活。因此，除了在序列依赖性货物识别中的经典作用外，人类（和更广泛的后生动物）Retromer 还作为一个 “组装点”，调节回收亚结构域中货物富集运输载体成功生物发生的步骤，包括 CROP 裂变因子和 EYA 蛋白的 PL 基序非依赖性组装。酵母五聚体 Retromer 中 VPS29 与分子内 PL 基序的结合在人类（和后生动物）中被释放，这使得 Retromer 能够成为内体回收亚结构域中局部肌动蛋白动力学和 RAB 开关调节的焦点。
Retriever 中的 VPS29 亚基是否与 Retromer 相关蛋白发挥相同的功能呢？事实并非如此。Retriever 是由 VPS26C、VPS35L 和 VPS29 组成的稳定异源三聚体，其稳定性部分源于 VPS35L 独特的延伸内在无序氨基末端区域，该区域与 VPS35L 羧基末端区域形成分子内关联（VPS35 中不存在这种延伸）。这种头对尾的配置使 VPS35L 无序氨基末端区域中的 PL 基序能够与 VPS29 中的疏水口袋结合。疏水口袋的封闭阻止了与外部 PL 基序的结合，因此 Retriever 无法与包括 TBC1D5、VARP 和 FAM21 在内的 Retromer 辅助蛋白结合。VPS29 的结构和功能在 Retromer 和 Retriever 中具有很大的背景特异性，Retromer 亚基的表达水平通常比 Retriever 高 10 倍以上。例如，在 HEK293T 细胞中，VPS35 的浓度为 800 nM，VPS35L 为 72 nM，VPS29A 的表达量足够高（约 1100 nM），可以同时存在于两个复合物中，且 VPS29 的表达水平大大超过 Retromer 辅助蛋白，这表明高阶 Retromer 组装体可能被这些辅助蛋白异质修饰，进一步强调了 Retromer 除了在序列依赖性货物识别中的 “经典” 作用之外的独特性。
ESCPE - 1 复合物 —— 获得新能力
从酵母 Retromer - SNX - BAR 五聚体的限制中 “权力分离”，使人类 ESCPE - 1 能够进化出直接识别货物蛋白序列的能力。SNX5 和 SNX6 的 PX 结构域获得了一个 38 个氨基酸的插入，这在酵母 Vps17 或其他任何 SNX 家族成员中都完全不存在。这个插入折叠成一个螺旋 - 环 - 螺旋结构，暴露一个疏水凹槽，用于与位于货物蛋白细胞质面区域的二分ФxΩxФ(x)nФ分选基序（x 为任意氨基酸，n 为可变连接区域）结合。超过 70 种人类货物含有这种基序，并利用 ESCPE - 1 将它们回收至细胞表面，包括 CI - MPR、SEMA4C、TRAILR1 和 IGF1R。
除了获得直接的货物识别能力外，ESCPE - 1 的其他亚基 SNX1 和 SNX2 还获得了与货物适配器分选衔接蛋白 - 27（sorting nexin - 27，SNX27）结合的能力。这是通过 SNX1 和 / 或 SNX2 在其无序氨基末端获得酸性 - Asp - Leu - Phe（aDLF）基序来实现的，这些基序直接与 SNX27 的 FERM 结构域中带正电荷的环状疏水凹槽结合。SNX27 包含另一个模块化结构域 —— 氨基末端 PDZ 结构域，它具有两种截然不同的功能：一是包含一个结合口袋，用于结合在其极端羧基末端具有特定 PDZ 结合基序亚群的货物，如 β2 - 肾上腺素能受体和葡萄糖转运蛋白 GLUT1；二是 SNX27 PDZ 结构域中暴露的 β - 发夹直接与 Retromer 的 VPS26A 和 VPS26B 亚基结合。重要的是，PDZ 结合基序与 PDZ 结构域的结合使对 Retromer 的亲和力提高一个数量级。这导致了一种模型，即驻留在内体膜上的 SNX27 捕获新到达的含有 PDZ 结合基序的货物，并将它们隔离到富含 Retromer 的回收亚结构域。（在 SNX17 捕获的货物转移到由 Retriever 划定的回收亚结构域中，发生了一个机制不同但概念等效的事件，货物与 SNX17 的结合解除了自抑制状态，从而促进了与亚结构域富集的 Retriever 的结合。）SNX27 - Retromer 与 ESCPE - 1 复合物的 SNX1/SNX2 亚基的直接结合，将捕获的货物转移到形成的管状 - 囊泡运输载体中，以便进行后续运输和回收。一种人类（和后生动物）特有的相互作用可能促进了这些事件，SNX27 FERM 结构域中相同的疏水凹槽也与 WASH 复合物亚基 FAM21 中的 aDLF 基序结合。结合之前讨论的 Retromer 与 FAM21 的直接结合机制，这些数据揭示了一个基于亲和力的系统中的多重低亲和力相互作用，该系统包含 “制衡” 机制，在内体回收亚结构域建立了一个高度动态的 SNX27 - Retromer - WASH - ESCPE - 1 组装体，调节序列依赖性货物识别和隔离，以及局部分支丝状肌动蛋白聚合和管状结构和管状 - 囊泡运输载体的生物发生。这些关联在酵母中均未观察到，可以说，如果没有从酵母 Retromer - SNX - BAR 五聚体到人类 Retromer 的 “权力分离”，这些可能不会进化出来。
结论和未来方向
Retromer 复合物在真核细胞和发育生物学中处于核心地位，在人类生理学和年龄相关性病理生理学中具有关键的神经保护作用。越来越多的功能数据和不断发现的 Retromer 辅助蛋白，为深入了解这个异源三聚体复合物的生物学特性提供了更多线索。Retromer 与辅助蛋白的相互作用通常通过低亲和力、多重相互作用介导，在回收亚结构域内建立了一个高度动态的相互作用网络，这使得通过实验剖析该网络以获得功能见解变得极具挑战性。
在进化过程中，虽然 SNX - BAR 蛋白和 Retromer 复合物在内体运输中发挥关键作用，但发生了 “权力分离”，酵母五聚体 Retromer - SNX - BAR 复合物的稳定性在高等真核生物中丧失。这一结果使得在高等真核生物中，VPS29 中的 PL 基序结合口袋更容易与关键辅助蛋白结合，这些辅助蛋白在维持 RAB GTP 酶内体身份和成熟，以及 WASH 介导的依赖 F - 肌动蛋白的内体 - 溶酶体网络组织中发挥重要作用。
在解释 Retromer 的功能时，除了其在序列依赖性内体货物回收和再循环中的经典作用外，还应考虑到它在组织和调节内体 - 溶酶体网络方面已经进化出更广泛的作用。Retromer 在控制对神经元突触组织、活动和神经元
