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为解决苜蓿花叶病毒（AMV）检测难题，研究人员开展了基于 RT - RPA - CRISPR - Cas12a 技术检测 AMV 的研究。结果显示，该技术能在约 1 小时内完成检测，灵敏度高且无交叉反应，为田间快速检测 AMV 提供了有效方法。
苜蓿，作为全球广泛种植的多年生豆科牧草，在农牧业生产中占据着举足轻重的地位。它不仅产量高、草质优、营养丰富，还在环境治理和土壤修复方面有着巨大潜力。我国为满足畜牧业发展需求，苜蓿种植面积逐年扩大，已成为全球第二大生产国。然而，苜蓿产业发展并非一帆风顺。
从贸易数据来看，我国苜蓿进口量高达 15,123.53 吨，而出口仅 42.3 吨，供需严重失衡，对外依存度高。更棘手的是，苜蓿极易遭受病毒侵害，其中苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus，AMV）堪称 “头号大敌”。感染 AMV 的苜蓿植株会出现花叶、矮化、畸形等症状，产量和品质大幅下降。研究表明，AMV 感染可使植株干重降低 37% - 66%，花粉授粉率下降 21.5%，根瘤形成减少 31% - 67% 。在我国八大苜蓿主产区，AMV 发病率高达 91.7% - 100%，并且它还能与多种其他苜蓿病毒共同感染，传播范围极广，严重威胁苜蓿产业的健康发展。
当前，虽然有一些方法可用于检测 AMV，如双抗体夹心酶联免疫吸附试验（DAS - ELISA）、逆转录聚合酶链反应（RT - PCR）、逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）、免疫试纸条、逆转录环介导等温扩增（RT - LAMP）和高通量测序（HTS）等，但这些方法或多或少都存在缺陷。像 DAS - ELISA 依赖抗体质量，RT - PCR 和 RT - qPCR 需要特定仪器，HTS 设备要求高且数据分析复杂，免疫试纸条易受植物色素干扰，RT - LAMP 引物设计复杂且对仪器有较高要求。因此，开发一种简单、快速、灵敏的 AMV 田间检测方法迫在眉睫。
为攻克这一难题，国内研究人员积极开展研究。他们致力于建立一种快速且简便的 AMV 检测方法，以满足田间检测的实际需求。最终，研究人员成功开发出三种新型检测方法，包括实时荧光逆转录重组酶聚合酶扩增（real - time fluorescent reverse - transcription recombinase polymerase amplification，RT - RPA）、基于单管一步法 RT - RPA - CRISPR - Cas12a 的荧光检测法，以及基于单管一步法 RT - RPA - CRISPR - Cas12a 的侧向流动分析法。综合考虑灵敏度、反应时间、操作便捷性以及仪器和试剂的便携性等因素，研究发现基于单管一步法 RT - RPA - CRISPR - Cas12a 的侧向流动分析法是最适合田间快速检测 AMV 的方法。这一成果对于及时发现和防控 AMV，保障苜蓿产业的稳定发展具有重要意义，相关研究成果发表在《Crop Protection》杂志上。
在研究过程中，研究人员采用了多种关键技术方法。首先是样本采集，从内蒙古、河北、北京和山西等地采集田间苜蓿样本用于病毒检测。然后利用 RNA 提取技术获取苜蓿植株的 RNA。在此基础上，运用单管一步法 RT - RPA 对 AMV 基因组 RNA 进行预扩增，接着借助 CRISPR - Cas12a/crRNA 对扩增产物进行序列特异性识别和对侧向流动报告分子（LF reporters）的非特异性切割，最后通过侧向流动分析法（LFD）对切割产物进行可视化检测。
研究结果主要围绕以下几个方面展开：
- 检测方法的建立与优化：研究人员基于 26 个 AMV 分离株的保守多功能外壳蛋白（multifunctional coat protein，CP）基因序列，设计了一对特异性 RT - RPA 引物和特异性 crRNA。通过一系列实验，确定了该检测方法在 42°C 和 37°C 等温条件下，利用便携式金属培养箱，约 1 小时即可完成检测。
- 灵敏度与特异性检测：灵敏度测试表明，该方法能够检测到低至 9.0 pg 的从感染 AMV 的苜蓿植株中提取的总 RNA。并且，该方法与其他苜蓿感染病毒病原体无交叉反应，展现出了高度的特异性。
- 田间样本检测验证：研究人员通过对田间采集的苜蓿样本进行检测，进一步验证了该检测方法的可行性，证明其能够在实际田间环境中有效检测 AMV。
研究结论表明，基于单管一步法 RT - RPA - CRISPR - Cas12a 的侧向流动分析法是一种快速、灵敏且可视化的 AMV 检测方法。该方法检测限低至 9.0 pg，能在约 1 小时内特异性检测田间生长的苜蓿植株中的 AMV。同时，一步法 RT - RPA 和 CRISPR - Cas12a 试剂可冻干保存，这为该方法在实际应用中的推广提供了便利。
在讨论部分，研究人员指出，等温核酸扩增技术因便携性和快速反应等优势，被视为实现田间快速检测的有效手段。与其他等温扩增技术如 RT - LAMP 相比，本研究开发的方法在引物设计、反应温度和检测特异性等方面具有明显优势。这一研究成果为苜蓿花叶病毒的田间监测提供了强有力的技术支持，有助于及时发现和处理感染植株，有效遏制病毒传播，对于保障苜蓿产业的可持续发展具有重要的现实意义。它不仅能够减少因病毒感染导致的苜蓿产量损失，还能提高苜蓿品质，促进我国苜蓿产业朝着更加健康、稳定的方向发展。
