CRISPR/dCas9 靶向编辑 H3K27me3：解锁植物发育奥秘的新钥匙

在植物研究领域，染色质修饰与基因表达关系尚不明确，H3K27me3对转录和细胞命运的影响也有待探究。研究人员利用 CRISPR-dCas9 系统，针对拟南芥 CUC3 基因开展研究，发现靶向去除 H3K27me3可影响植物发育。该研究为剖析染色质修饰功能提供新视角。

　　在生命科学的微观世界里，植物的生长发育一直是科学家们热衷探索的神秘领域。染色质，这个遗传信息的 “储存库”，其修饰方式对基因表达有着至关重要的影响。其中，H₃K27me₃修饰在真核生物中高度保守，被认为与发育基因的抑制密切相关。然而，长久以来，科学家们面临着诸多困惑：染色质修饰与基因表达模式之间究竟是怎样的因果关系？H₃K27me₃修饰对转录和细胞命运的直接作用是什么？以往的研究方法，大多是通过对相关突变体的表征以及全基因组范围的标记和因子结合分析来推测 H₃K27me₃的功能，但这些方法受到染色质标记传播者多方面复杂相互作用的影响，难以得出明确结论。为了攻克这些难题，来自法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学（Grenoble Alpes University）等机构的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在《iScience》杂志上。

研究人员为了深入探究 H₃K27me₃修饰的真正功能，运用了一种创新的技术手段 ——CRISPR-dCas9 SUperNova（SunTag）系统。这一系统就像是一把精准的 “分子剪刀”，能够对特定基因区域的染色质修饰进行靶向操作。研究人员将目标锁定在拟南芥的 CUP SHAPED COTYLEDON 3（CUC3）基因上，该基因是植物器官边界基因，在植物发育过程中起着关键作用。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是利用生物信息学工具设计特异性的单链引导 RNA（sgRNA），精准定位到 CUC3 基因区域；二是采用染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链式反应（ChIP-qPCR）技术，检测 H₃K27me₃在 CUC3 基因位点的富集程度；三是运用逆转录 - 定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），分析 CUC3 基因的表达水平。

研究人员首先选择 CUC3 基因作为 H₃K27me₃编辑策略的目标位点。这是因为 H₃K27me₃是植物茎尖组织特异性表达模式的主要决定因素，而 CUC3 基因在茎尖差异表达，界定了茎尖分生组织与器官原基之间的边界。研究人员将拟南芥 JUMONJI13（JMJ13）去甲基化酶的 Jumonji C 结构域（JMJC）整合到 dCas9 SunTag 系统中，构建了 dCas9-JMJ13^CUC3工具。通过设计 3 条 sgRNA，引导 dCas9-JMJ13 的活性作用于 CUC3 基因组区域。实验结果显示，在长日照条件下，携带 dCas9-JMJ13^CUC3工具的 SunTagJMJ13gCUC3 植株，其莲座叶面积显著小于对照组，叶长宽比更低，呈现出更小更圆的叶片表型。成年植株还出现了主茎尖分生组织分裂、茎干分叉等发育异常现象。这表明 dCas9-JMJ13^CUC3工具导致了 CUC3 基因的异位去抑制。进一步分析发现，dCas9-JMJ13^CUC3激活了 CUC3 基因的转录。从 pCUC3::CFP 报告基因的荧光信号分析来看，SunTagJMJ13gCUC3 幼苗的荧光信号更强、覆盖面积更大，说明 pCUC3 启动子的转录活性增强。RT-qPCR 结果也显示，SunTagJMJ13gCUC3 植株中 CUC3 基因的 mRNA 水平相较于对照组有 2 - 7 倍的提升。同时，ChIP-qPCR 检测发现，SunTagJMJ13gCUC3 植株中 CUC3 基因位点的 H₃K27me₃丰度显著降低，尤其是在第一外显子区域，降低了 5 - 10 倍。而且，研究还证实该编辑工具对 CUC3 基因具有高度特异性，不会对 CUC1 和 CUC2 基因产生脱靶效应。

这项研究意义重大。它首次利用 CRISPR/dCas9 系统，成功在植物体内特异性去除 H₃K27me₃标记，揭示了 H₃K27me₃介导的抑制作用与植物发育结果之间的直接联系。这不仅为研究染色质修饰在植物发育中的功能提供了有力的实验依据，还验证了一种剖析植物染色质结构和转录动力学中单个组蛋白标记作用的有效方法。通过精确的染色质编辑工具，科学家们能够更深入地探究染色质标记对基因表达和细胞分化的影响，为未来研究转录可塑性和植物发育过程提供了新的思路和技术支持。同时，研究中发现的编辑工具存在的局限性，也为后续研究指明了方向，有望通过改进技术手段，实现更精准、更高效的植物表观基因组编辑。