人诱导多能干细胞来源纳米囊泡通过AKT/YAP通路实现心肌细胞保护与增殖的突破性研究

本研究针对成年哺乳动物心肌细胞(CMs)再生难题，创新性利用CRISPR/Cas9基因编辑构建低免疫原性人诱导多能干细胞(hiPSCs)系，通过纳米挤出技术制备B2MKOhiPSC-NVs。研究发现单细胞可产生约9500个纳米囊泡，其富含纺锤体蛋白、染色体蛋白及ROS清除蛋白，能通过激活AKT通路减轻缺氧损伤，通过YAP通路促进增殖，并在小鼠心脏缺血再灌注(I/R)模型中显著改善心功能。该研究为心肌修复提供了新型无细胞治疗策略，发表于《Bioactive Materials》。

　　

心脏作为人体最重要的器官之一，其损伤修复一直是医学界的重大挑战。成年哺乳动物心肌细胞在出生后不久便退出细胞周期，导致心肌梗死后的自我修复能力极其有限。尽管人类诱导多能干细胞(hiPSCs)具有分化为心肌细胞的潜力，但直接移植存在致瘤风险和免疫排斥问题。近年来，外泌体(EVs)等细胞外囊泡因其携带母细胞生物活性物质的特点成为研究热点，但天然EVs产量低、制备繁琐的缺陷制约了临床应用。

美国阿拉巴马大学伯明翰分校的研究团队另辟蹊径，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除hiPSCs中的β2-微球蛋白(B2M)基因，创建了低免疫原性的B2MKOhiPSCs。研究人员创新性地采用纳米挤出技术，将完整细胞物理破碎为纳米囊泡(NVs)，单细胞产量高达9500个，是传统EVs制备方法的52倍。蛋白质组学分析揭示这些B2MKOhiPSC-NVs富含纺锤体相关蛋白、染色体调控蛋白、细胞周期蛋白以及活性氧(ROS)清除蛋白，形成了独特的"分子武器库"。

研究采用的关键技术包括：1) CRISPR/Cas9基因编辑构建B2MKOhiPSCs；2) 纳米挤出联合超速离心制备NVs；3) 纳米颗粒追踪和透射电镜表征NV特性；4) 蛋白质组学分析 cargo成分；5) 缺氧和H₂O₂诱导的体外心肌损伤模型；6) 小鼠心脏I/R手术模型评估治疗效果。

3.1 B2MKOhiPSC-NVs的制备与特性
通过删除B2M基因198-bp片段获得克隆C66，流式细胞术证实其HLA-I/II表达缺失。纳米挤出制备的NVs直径115.9±40.7 nm，zeta电位-13.29 mv，电镜显示典型双层膜结构。PKH67标记实验证实NVs可被hiPSC-CMs内化并在细胞内持续存在4天，且仅有40%进入溶酶体降解途径，提示多数NV cargo能发挥生物学功能。

3.3 蛋白质组学特征
质谱鉴定出4922种NV蛋白，其中83%与母细胞共享。显著富集的4种ROS清除蛋白(PRDX2/6、GSR、NUDT2)能直接分解H₂O₂；16种纺锤体蛋白(如TPR、SKA2)和24种细胞周期蛋白(如Ki-67含量增加887.6%)构成促增殖网络。蛋白互作分析显示这些分子通过协同作用激活下游通路。

3.4-3.5 心肌保护机制
在缺氧条件下，B2MKOhiPSC-NVs剂量依赖性地降低LDH泄漏(从6.25×10⁸/mL起效)，使细胞存活率提升40%。Western blot显示AKT磷酸化在0.5-6小时持续激活，抑制剂MK-2206可完全阻断这种保护作用。对H₂O₂的清除实验证实NV cargo能直接中和ROS，200 μM H₂O₂浓度可被降低60%。

3.6 增殖调控机制
5×10⁹/mL NVs处理使hiPSC-CMs的pH3⁺细胞增加6.9倍，G2/M期细胞比例显著升高。机制研究发现YAP蛋白在6小时表达上调，核转位增加，而抑制剂Verteporfin可抑制这种促增殖效应。

3.7-3.8 动物实验验证
小鼠I/R模型显示，NV治疗组4周后射血分数(EF)改善30%，梗死面积减小45%。免疫荧光在梗死区检测到PKH67⁺ NVs被内化，pH3⁺和ABK⁺心肌细胞密度分别是对照组的5.7倍和6.9倍，证实NV能激活内源性心肌细胞增殖。

这项研究开创性地将基因编辑技术与纳米囊泡制备相结合，解决了干细胞治疗面临的免疫排斥和致瘤风险两大瓶颈。B2MKOhiPSC-NVs不仅具有规模化生产优势，其独特的"多靶点武器库"能同时实现心肌保护(通过AKT)和增殖诱导(通过YAP)，在心肌梗死治疗中展现出巨大潜力。尤为重要的是，冻存后的NV仍保持生物活性，为临床转化提供了制剂稳定性保障。该成果为开发"现货型"心肌修复疗法奠定了理论基础，代表再生医学领域的重大突破。