基于三重DNAzyme级联信号放大的高灵敏川崎病相关microRNA检测新方法

本研究针对microRNA（miRNA）检测中存在的低丰度、高同源性和样本干扰等挑战，开发了一种无酶参与的三重DNAzyme级联信号放大系统。通过设计可编程的DNAzyme发夹探针（S1/S2/S3），实现了对川崎病（KD）标志物miRNA-141的超灵敏检测（检测限达fM级）。该系统通过上游DNAzyme电路（cycle-1）、中间电路（cycle-2）和下游DNAzyme电路（cycle-3）的三级级联反应，显著提高了选择性和信号放大效率，为疾病早期诊断提供了新工具。

　　

研究背景与意义
microRNA（miRNA）作为基因调控的关键分子，在川崎病（KD）等疾病中表现出显著的诊断潜力。然而，传统检测方法如Northern blotting耗时费力，RT-qPCR面临引物设计困难，而基于纳米材料的方法易受酶干扰产生假阳性。更棘手的是，miRNA存在序列短、丰度低、同源性强等特性，使得临床检测的灵敏度和特异性难以兼顾。

研究设计与方法
研究人员开发了一种基于Mg²⁺依赖性DNAzyme的三级级联系统。该系统包含三个发夹探针：S1探针通过暴露识别单元特异性结合miRNA-141，触发DNAzyme自剪切并释放"4"序列（cycle-1）；"4"序列激活S2探针中的分裂DNAzyme（D1/D2），剪切"6"-"5"底物释放"6"序列（cycle-2）；"6"序列最终触发荧光探针（FP）上的DNAzyme剪切Cy5标记片段，使其从金纳米颗粒（AuNPs）表面解离产生信号（cycle-3）。实验采用KD患者血浆样本，通过荧光光谱和凝胶电泳验证系统性能。

研究结果

1. 可行性验证：S1探针的闭环结构使Cy5荧光淬灭率达90%，而靶标结合后信号恢复15倍，证实探针构象转换有效。
2. 灵敏度与特异性：对miRNA-141的检测限低至0.3 fM，并能区分单碱基错配的同源miRNA。
3. 临床样本检测：在50例KD患者血浆中检出miRNA-141表达量显著高于健康对照组（p<0.01）。

结论与意义
该研究首创的三重DNAzyme级联系统具有四大优势：（1）无酶设计避免背景干扰；（2）三级放大实现fM级灵敏度；（3）发夹探针提升特异性；（4）模块化设计可拓展至其他miRNA检测。相关成果发表于《Analytical Biochemistry》，为KD的早期诊断提供了新思路，其通用性设计也为其他疾病标志物检测提供了技术参考。