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为解决神经母细胞瘤（NB）免疫治疗难题，研究人员开展 PVR/PVRL2 - TIGIT 轴及 GD2 - CAR NK - 92 细胞相关研究。结果显示，该轴虽有潜力，但敲除 TIGIT 不能增强 GD2 - CAR NK - 92 细胞毒性。这为 NB 免疫治疗提供新思路。
在儿童癌症的世界里，神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是个让人头疼的 “大反派”。它是儿童最常见的颅外实体肿瘤，在 15 岁以下患者的恶性肿瘤中占比超过 8 - 10% ，高危患者的生存率还不到 45%。更糟糕的是，50 - 60% 的患者在治疗后会复发，5 年生存率低于 20%。目前针对高危 NB 的免疫治疗，比如使用靶向神经节苷脂 GD2 的单克隆抗体 Dinutuximab，虽然有一定效果，还成了标准疗法，但不仅效果有限，还会带来像神经性疼痛这样严重的副作用。而 GD2 - 嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）T 细胞疗法虽然在 NB 患者身上没这些副作用，还提高了复发或难治性高危 NB 患者的生存率，可还有提升空间。
肿瘤细胞很狡猾，会在自己表面弄出一些配体，构建出免疫抑制微环境，阻碍免疫细胞发挥作用。其中一个重要的免疫逃逸机制，就是肿瘤细胞表面的配体和免疫细胞上的抑制性检查点蛋白结合，让免疫细胞没法好好工作，产生不了足够的抗癌免疫反应。这时候，免疫检查点（Immune checkpoint，IC）抑制剂疗法出现了，像阻断细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4（Cytotoxic T lymphocyte - associated protein 4，CTLA - 4）、程序性细胞死亡蛋白 1（Programmed cell death protein 1，PD - 1）及其配体 1（PD - L1）等，能重新激活细胞毒性免疫细胞，对抗肿瘤。不过，只有部分癌症患者对这些疗法有反应，所以探索其他 IC 轴很有必要。
最近，涉及脊髓灰质炎病毒受体（Poliovirus receptor，PVR，CD155）、脊髓灰质炎病毒受体样 2（Poliovirus receptor - like 2，PVRL2，CD112）和含免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域的 T 细胞免疫受体（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）的 IC 轴，成了癌症免疫治疗的新希望，在急性髓系白血病等多种恶性肿瘤中都被证明很重要，在 NB 中也被认为是潜在的免疫治疗靶点。
为了深入了解这个 IC 轴在 NB 中的作用，以及 GD2 - CAR NK - 92 细胞和基于 CRISPR 的 TIGIT 基因敲除联合治疗 NB 的效果，德国汉堡儿童癌症中心研究所、汉堡 - 埃彭多夫大学医学中心儿科干细胞移植和免疫学部门的 Wiebke Jünemann、Isabelle Bley 等研究人员展开了研究，相关成果发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上。
研究人员主要用到了以下几种关键技术方法：一是利用已有的 RNA - seq 数据，分析 NB 细胞系和患者样本中相关分子的表达情况；二是使用 CRISPR/Cas9 系统构建 PVR、PVRL2 和 TIGIT 单敲除和双敲除细胞系；三是通过慢病毒转导等技术制备 GD2 - CAR NK - 92 细胞；四是运用流式细胞术检测细胞表面分子表达、细胞毒性、脱颗粒和细胞因子分泌等情况。
下面来看具体的研究结果：
- PVR 和 PVRL2 作为潜在的 IC 分子：通过分析已有的 RNA 测序数据，发现 NB 细胞系中 PVR、PVRL2 和 B7 - H3 的表达比 PD - L1、HVEM 和 B7 - H4 高。分析患者样本数据发现，高 PVR 表达与患者无事件生存率降低显著相关，高 PVRL2 表达虽与无事件生存率降低有关，但不具有统计学意义。高 PVR 表达还会降低总生存率，而高 PVRL2 表达与较高的总生存率相关。在不同风险组的患者中，情况也有所不同。通过流式细胞术检测多种 NB 细胞系表面 PVR 和 PVRL2 的蛋白表达，根据表达情况选择了 LAN - 1、SK - N - LO 和 SH - EP 细胞系用于后续实验。
- 基于 CRISPR/Cas9 的 NB 细胞系中 PVR 和 PVRL2 的有效敲除：用 CRISPR/Cas9 技术对 SK - N - LO、SH - EP 和 LAN - 1 细胞系进行基因编辑，筛选出单克隆细胞，获得了单敲除和双敲除克隆。经检测，这些克隆细胞表面相应的 IC 分子完全缺失。但细胞毒性实验表明，敲除 PVR 或 PVRL2 并没有增强 NK - 92 细胞对 NB 细胞的裂解作用。研究人员还检测了 NB 细胞上其他与 TIGIT 相互作用的受体，发现 Nectin - 4 在三种 NB 细胞系中均不表达，Nectin - 3 在野生型 NB 细胞中均为阳性，在 SH - EP 和 LAN - 1 细胞中，敲除 PVR、PVRL2 或两者后其表达不变，而在 SK - N - LO 细胞中，敲除 PVR 或 PVRL2 会导致 Nectin - 3 表达缺失。
- NK - 92 细胞上 PVR 和 PVRL2 相互作用伙伴的表达：通过流式细胞术检测发现，NK - 92 细胞不表达激活受体 DNAX 辅助分子 1（DNAX accessory molecule - 1，DNAM - 1，CD226），高表达抑制受体 TIGIT ，PD - 1 和 CTLA - 4 表达频率很低。而健康供体的原代 NK（pNK）细胞不表达 TIGIT，强烈表达 DNAM - 1 ，表达一定水平的 PD - 1 ，基本不表达 CTLA - 4。用 IL - 2 和 IL - 15 刺激 pNK 细胞 24 小时，受体表达没有明显变化。
- NK - 92 细胞中 TIGIT 的敲除增强了对 NB 细胞系的细胞毒性：用 CRISPR/Cas9 技术敲除 NK - 92 细胞中的 TIGIT，获得 TIGIT-/-NK - 92 细胞。与野生型 NK - 92 细胞相比，TIGIT-/-NK - 92 细胞对 SK - N - LO 和 SH - EP 细胞的裂解作用增强，但对 LAN - 1 细胞的杀伤作用没有改变。将 NB 敲除细胞与野生型 NK - 92 细胞和 TIGIT-/-NK - 92 细胞共培养，发现 TIGIT-/-NK - 92 或野生型 NK - 92 细胞与敲除靶细胞共培养时，细胞毒性没有增强，但 TIGIT-/-NK - 92 细胞对某些敲除细胞（如 PVR-/-SK - N - LO、PVRL2-/-SK - N - LO 等）的裂解作用增强。
- 额外的激活信号改善了细胞毒性活性：由于 NK - 92 细胞不表达 DNAM - 1，研究人员给其装备了 GD2 - CAR。实验表明，GD2 - CAR NK - 92 细胞对 SK - N - LO 和 LAN - 1 细胞的裂解作用比野生型 NK - 92 细胞显著增强，但 TIGIT-/-GD2 - CAR NK - 92 细胞与 GD2 - CAR NK - 92 细胞相比，细胞毒性没有显著增强。脱颗粒和干扰素 - γ 释放实验也证实，只有 GD2 - CAR NK - 92 细胞在与 SK - N - LO 或 LAN - 1 细胞共培养后脱颗粒增加，TIGIT-/-GD2 - CAR NK - 92 细胞的干扰素 - γ 水平没有升高。
综合来看，研究结果表明 PVR/PVRL2 - TIGIT 检查点轴可能是 NB 的新免疫治疗靶点。虽然敲除 PVR 或 PVRL2 不能增强 NK - 92 细胞的细胞毒性，但敲除 TIGIT 能增强对部分 NB 细胞的裂解作用。不过，TIGIT 敲除并不能进一步提高 GD2 - CAR NK - 92 细胞的细胞毒性，这可能是因为该检查点网络中其他受体的影响，或者是 GD2 - CAR 引发的信号已达饱和，不受其他信号通路影响。
这项研究意义重大，它确认了 PVR/PVRL2 - TIGIT 网络在 NB 中的重要作用，强调了这个 IC 网络的复杂性，单一受体的抑制或激活不足以成为有效的治疗方案。虽然敲除 NK - 92 细胞中的 TIGIT 有一定效果，但还需要更深入研究整个网络。未来，可以考虑针对这个网络中的多个受体，甚至是网络之外的靶点进行联合治疗，有望将其与 GD2 - CAR 细胞联合，为 NB 的免疫治疗开辟新道路，给众多受神经母细胞瘤困扰的患者带来新的希望。
