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在毕赤酵母（Komagataella phaffii）异源基因表达面临诸多挑战的背景下，研究人员开展了利用 CRISPR/Cas9 技术实现表达盒无痕整合的研究。结果表明该技术能有效整合，还成功表达分泌鸡卵清蛋白。这为重组蛋白生产提供新途径。
在生物技术蓬勃发展的当下，微生物细胞工厂成为生产重组蛋白的热门选择，其中毕赤酵母（Komagataella phaffii，曾用名 Pichia pastoris ）凭借高分泌能力、可进行多种翻译后修饰以及拥有丰富分子生物学工具等优势，在重组蛋白表达领域备受青睐。近年来，一些在毕赤酵母中生产的动植物食品蛋白，已通过美国市场 “公认安全”（GRAS）认证并上市销售。然而，传统的毕赤酵母表达系统存在不少问题。经典表达系统常使用整合载体，通过单交叉同源重组整合到基因组中，但这种方式存在局限性，比如整合载体不稳定，且需要选择标记，而抗生素抗性标记不适合用于食品蛋白生产，营养缺陷型菌株又存在生长障碍。同时，整合载体的使用还会导致高克隆变异性，需要耗费大量人力筛选合适的表达克隆。
为了解决这些难题，来自挪威食品、渔业和水产养殖研究机构（Nofima）的研究人员展开了深入研究。他们的目标是创建一种便捷的无痕敲入方法，利用 CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列 / CRISPR 相关蛋白 9）技术将表达盒整合到毕赤酵母染色体中，并评估该系统生产分泌型重组食品蛋白的效率和适用性 。最终，研究取得了重要成果，证明了优化后的 GoldenPiCS 工具包结合 CRISPR/Cas9 技术，能够实现毕赤酵母中高效精确的基因组整合，为扩大高价值重组蛋白的生产带来了新希望。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上。
在研究方法上，研究人员主要运用了以下关键技术：一是基于 Golden Gate 克隆构建质粒，通过该技术构建了 Cas9/sgRNA（单导向 RNA）质粒和相应的供体辅助质粒；二是进行细胞转化，将构建好的质粒共转化到毕赤酵母细胞中；三是利用全基因组测序（WGS）分析基因拷贝数变异等情况。
研究结果主要从以下几个方面展开：
- 质粒设计与构建：构建了三种 Cas9/sgRNA 质粒（CRISPi_04576、CRISPi_PFK1 和 CRISPi_ROX1）以及对应的供体辅助质粒（crBB3 质粒）。这些供体辅助质粒含有用于同源定向修复的同源区域，可用于克隆一个或两个表达单元 。
- 转化与整合效率差异：在评估选定的三个靶位点（04576、PFK1 和 ROX1）的整合效率时发现，不同位点的转化和整合效率存在显著差异。04576 位点整合效率最高，ROX1 位点转化效率最高。并且，电穿孔后恢复时间延长，整合效率有所提高 。
- 分泌型卵清蛋白的表达：通过在毕赤酵母中表达鸡卵清蛋白（OVA），验证了该方法在生产重组食品蛋白方面的潜力。实验中，以酿酒酵母 α - 交配因子（α -MF）为分泌信号，成功表达并分泌出卵清蛋白，且不同克隆间蛋白表达水平差异较小 。
- eGFP 表达克隆的荧光强度差异：对表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的克隆进行分析，发现不同靶位点及同一靶位点的不同克隆间荧光强度存在差异。这表明 CRISPR/Cas9 方法导致 eGFP 表达盒拷贝数不同 。
- 基因拷贝数变异评估：通过全基因组测序分析发现，低荧光克隆含有单拷贝表达盒，而中、高荧光克隆存在多个拷贝的表达盒及质粒骨架片段插入。此外，ROX1 位点整合后，部分克隆出现染色体末端缺失的情况，但未观察到脱靶整合现象 。
研究结论和讨论部分指出，该研究开发的 CRISPR/Cas9 介导的毕赤酵母无痕整合工具包，结合了 Golden Gate 克隆和模块化的 GoldenPiCS 系统，成功用于生产分泌型重组蛋白，尤其是鸡卵清蛋白。不同整合位点在转化效率、整合效率、荧光水平等方面存在差异，这可能与 sgRNA 序列及细胞修复机制的差异有关。虽然多拷贝基因插入存在一些问题，如克隆不稳定等，但可通过对 DNA 进行预处理等方法加以改善。此外，研究首次利用 CRISPR/Cas9 技术在微生物中生产重组鸡卵清蛋白，为食品工业生产提供了新的思路。未来研究应聚焦于优化整合位点、改进克隆程序，以进一步提高系统的效率和通用性，充分发挥该技术在重组蛋白生产领域的潜力。
