金纳米颗粒-Cas13d基因编辑系统：靶向RNA病毒的新型抗病毒策略

这篇研究突破性地开发了基于金纳米颗粒（Au_NPs）递送的Cas13d基因编辑系统，通过自发内吞途径靶向切割SARS-CoV-2和ZIKV的RNA基因组。实验证明Au_NPs-Cas13d复合物能高效共定位于早期内体（EEA1+），单次给药即可使SARS-CoV-2复制降低90%，其切割效率与脂质体转染的核糖核蛋白（RNP）相当（99.8%）。该研究为无转染需求的抗RNA病毒疗法提供了创新递送方案。

　　

金纳米颗粒-Cas13d系统的构建与表征
研究团队选择直径12nm的球形金纳米颗粒（Au_12_PEG3000NTA_C）作为载体，通过镍离子螯合作用将带有His标签的Cas13d定向固定在纳米颗粒表面。动态光散射（DLS）分析显示，功能化后的Au_NPs粒径保持23.76±11.04nm，Zeta电位为-24.3±8.48mV，与裸纳米颗粒相比无显著差异。透射电镜证实Cas13d成功结合后，纳米颗粒仍保持单分散状态。

病毒靶向gRNA的设计筛选
针对SARS-CoV-2和寨卡病毒（ZIKV）的保守区域，研究人员设计了8种向导RNA（gRNA）。通过构建稳定表达Cas13b的Huh-7细胞系，发现靶向SARS-CoV-2依赖RNA的RNA聚合酶（RdRP）和核衣壳蛋白（N）的gRNA效果最佳，可使病毒拷贝数降低1个数量级；而靶向ZIKV非结构蛋白NS1的gRNA仅显示25%的抑制率。高内涵成像分析进一步验证，RdRP-gRNA能减少90%的SARS-CoV-2感染细胞。

纳米载体的细胞摄取机制
标记Alexa546的Au_NPs-Cas13d在15分钟内即可进入细胞，4小时达到峰值浓度。通过抑制剂阻断实验揭示其通过三条主要途径内化：50%依赖被动扩散，35%通过网格蛋白介导的内吞（CME），剩余部分通过快速内吞素介导的内吞（FEME）和巨/微胞饮作用。共聚焦显微镜显示21%的纳米颗粒与早期内体标志物EEA1共定位，显著高于脂质体转染组（7%）。活细胞追踪证实Au_NPs-Cas13d在胞质内可稳定存在12小时以上。

抗病毒效力的差异化表现
在SARS-CoV-2感染的Huh-7细胞中，单次给药Au_NPs-Cas13d使病毒释放量降低5倍，而传统RNP转染无显著效果。透射电镜观察到纳米颗粒与病毒颗粒在早期内体中的共定位现象。但对ZIKV的抑制效果截然不同：虽然入胞阶段可见共定位，但在病毒复制中心——高尔基体膜囊中几乎检测不到纳米颗粒，导致其抗ZIKV活性仅为脂质体RNP的1/4。多次给药可提升抑制效果，使ZIKV基因组减少2个数量级。

脱靶效应的精准控制
生物信息学预测187个潜在脱靶位点，但转录组分析仅发现9个基因表达下调。这种高特异性源于Cas13d的定向固定方式以及纳米颗粒的内体区室化分布，有效减少了与胞质mRNA的非特异性接触。体外切割实验证实，在病毒RNA:RNP比例为1:60时，Au_NPs-Cas13d与游离Cas13d的切割效率均达99.8%。

转化医学前景与挑战
该研究首次实现CRISPR-Cas13d的无转染递送，其气溶胶化特性为呼吸道病毒防治提供新思路。但Cas13d的多靶点处理能力有限，且对ZIKV等依赖特殊复制区室的病毒效果欠佳。未来需优化Cas蛋白的持续活性，并解决肺部给药可能遇到的黏液屏障问题。研究者计划在hACE2转基因小鼠中验证雾化制剂的抗SARS-CoV-2效果，这将为应对新发RNA病毒疫情储备关键技术。