番茄全基因组多靶点CRISPR文库构建：突破功能冗余实现规模化基因编辑

为解决植物基因功能冗余和传统诱变技术靶向性差的问题，Amichai Berman团队开发了番茄全基因组多靶点CRISPR文库系统。研究设计15,804个靶向同源基因家族的sgRNA，构建10个功能分类子文库，通过CRISPR-GuideMap双条形码追踪技术，在1,300株转基因番茄中鉴定出果实发育、风味及抗病等表型突变体。该研究为作物育种和功能基因组研究提供了规模化克服基因冗余的新工具，成果发表于《Nature Communications》。

　　

在作物育种和遗传研究中，基因功能冗余一直是阻碍性状解析的关键瓶颈。传统化学诱变或辐射诱变虽能产生随机突变，但存在靶向性差、连锁遗传难以打破等固有缺陷。CRISPR-Cas9技术虽能精准编辑基因，但单靶点策略难以应对植物基因组中高达64.5%的同源基因家族。特别是在番茄等重要作物中，功能冗余导致许多关键农艺性状的遗传机制仍未被充分揭示。

以色列特拉维夫大学Eilon Shani团队与中国科学院遗传发育所Yuqin Zhang团队合作，开发了首个番茄全基因组多靶点CRISPR文库系统。研究通过CRISPys算法设计15,804个sgRNA，每个sgRNA可靶向2-8个同源基因，平均覆盖10,036个基因（占番茄基因组的29.5%）。这些sgRNA被划分为10个功能子文库，包括转运蛋白（ABC、MFS等）、转录因子（MYB、WRKY等）和酶类功能组。研究团队利用双元载体pMR284进行农杆菌转化，在M82和Ailsa Craig两种番茄背景中获得了1,300株独立转基因株系。

关键技术包括：1）基于CRISPys算法的多靶点sgRNA设计；2）CRISPR-GuideMap双条形码追踪系统实现sgRNA高通量鉴定；3）低磷酸盐胁迫和病原体接种等表型筛选体系；4）全基因组测序验证突变效率。

多靶点CRISPR文库设计与验证
通过MAFFT比对和系统发育分析将番茄基因聚类，CRISPys算法针对每个亚群设计sgRNA，要求切割效率预测值（CFD）>0.8。结果显示95%的sgRNA靶向2-3个基因，平均每个sgRNA存在1.21个错配。深度测序证实各子文库覆盖率>99%，且sgRNA分布均匀（偏度0.02-0.26）。

CRISPR-GuideMap条形码系统
在253株M82转基因植株中，通过64对8bp条形码引物组合实现单株sgRNA鉴定。78%植株携带单sgRNA，17%携带双sgRNA，与常规转化效率一致。该系统与Sanger测序结果吻合度达95%，并能检测到NPF1.10/11/12基因簇的10.7kb大片段缺失。

关键表型发现
在NPF1亚家族突变体中，npf1.10/11/12双等位基因株系对Xanthomonas ewesicatoria的敏感性显著增加（3 DPI菌落数提高3倍），揭示了氮转运蛋白与抗病性的新关联。低磷条件下，磷酸盐转运蛋白PT2/PT6双突变体根系表面积减少35%，首次证明这对串联重复基因在番茄磷吸收中的功能冗余。

果实性状调控
在1,062株Ailsa Craig突变体中筛选出125株果实表型变异株。ERF118-like转录因子双突变导致果实可溶性固形物（Brix）含量降低；AP2家族基因编辑株系出现果实形状改变和种子数减少；ARF2B/ARF3双突变则产生无籽表型，为番茄品质改良提供了新靶点。

该研究通过多靶点编辑策略成功突破了作物基因功能冗余的技术壁垒，CRISPR-GuideMap系统实现了文库规模化的精准追踪。发现的NPF1亚家族与抗病性、PT2/PT6与磷吸收等新机制，为作物抗逆育种提供了分子基础。特别值得注意的是，81.5%的有效突变体涉及遗传连锁基因（如串联重复的PT2/PT6），证明该方法能有效解决传统育种中"连锁累赘"难题。研究建立的标准化流程可拓展至水稻、小麦等作物，为复杂性状的遗传解析和精准育种提供了通用平台。