探秘副溶血性弧菌致病岛 VpaI - 7 中 CRISPR/Cas 转座系统：调控、功能与潜在影响

本文聚焦副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）致病性岛 VpaI - 7 中的 CRISPR/Cas 转座系统（CAST）。研究发现该系统转录活跃，其启动子受多种调控。且在宿主菌内转座效率更高，这对理解细菌致病机制及演化意义重大。

　　

引言

副溶血性弧菌是一种广泛存在的细菌，可定植于海洋动物肠道并引发人类肠胃炎。其致病性与多种毒力因子相关，如三种溶血素（TDH、TRH、TLH）和两种 III 型分泌系统（T3SS1、T3SS2） 。致病性岛 VpaI - 7 编码了部分毒力因子，可能通过水平基因转移（HGT）获得，其传播可能导致细菌致病性增强。

近期发现的一类 Tn7 家族转座子，被称为 CRISPR 相关转座子（CASTs），其转座机制涉及 TnsABC 转座酶、TniQ 家族蛋白和简约型 CRISPR/Cas 系统。简约型 CRISPR/Cas 系统缺乏典型 CRISPR/Cas 系统的部分功能，主要通过 crRNA 与靶位点的碱基互补引导转座。

VpaI - 7 岛经序列分析显示为 CAST，其两侧有 Tn7 - 样末端序列，编码多种相关蛋白及两个 CRISPR 阵列（典型和非典型）。然而，目前对 CAST 系统在其天然宿主中的功能和调控了解有限，本研究旨在探究副溶血性弧菌中VpaCAST 系统的生理相关性。

结果

1. CRISPR/Cas 介导转座相关基因在副溶血性弧菌 RIMD2210633 中转录活跃：通过 RT - PCR 分析发现，tniQ、cas8、cas7、cas6、tnsA、tnsB和tnsC基因均有转录，且存在潜在的多顺反子转录本，如tniQ - cas8、cas8 - cas7等。比较野生型（WT）和tniQ启动子插入突变株的基因表达，发现tniQ启动子主要影响tniQ和cas8的表达，表明tniQcas876基因簇可能包含复杂的操纵子和内部启动子。利用 BPROM 程序预测，发现所有分析基因的上游均有启动子，且通过构建转录融合报告基因实验证实了多个基因及 CRISPR 阵列上游启动子的活性，这些启动子活性水平各异。
2. tniQ、非典型 CRISPR 阵列、VPA1391（vpxR）和 VPA1392 的启动子在副溶血性弧菌中受转录调控：VPA1391 编码的蛋白 VpxR 是 Xre 家族转录调节因子，之前在异源宿主大肠杆菌中的研究表明其对非典型 CRISPR 阵列表达有调控作用。本研究通过构建转录融合、突变株和过表达质粒等实验，发现 VpxR 在副溶血性弧菌中能正向调节自身启动子（P*_vpxR），负向调节 VPA1392 启动子（P_VPA1392） 。对非典型 CRISPR 阵列启动子（P_crAtyp） ，只有在 VpxR 过表达时才表现出明显的抑制作用。此外，生物信息学分析发现tniQ调控区域有 ToxR 结合位点，实验表明 ToxR、LeuO 和 H - NS 可调节 P_tniQ的表达，且对 VPA1392 启动子也有显著影响，但它们对Vpa*CAST 系统其他基因的调控作用不明显。
3. 表达VpaCAST 系统的合成构建体在大肠杆菌和副溶血性弧菌中促进 mini - CAST 可编程插入的效率不同：与VchCAST 系统相比，VpaCAST 系统在大肠杆菌中介导转座效率较低。通过比较两者蛋白的氨基酸保守性、TnsB 结合位点及 CRISPR 阵列重复序列的保守性，发现存在一定差异。为研究VpaCAST 系统在不同宿主中的转座效率，构建了基于副溶血性弧菌的VpaINTEGRATE 质粒，并与VchINTEGRATE 质粒进行比较。实验结果显示，VchINTEGRATE 系统在大肠杆菌中促进转座更有效，而VpaINTEGRATE 系统在副溶血性弧菌背景下转座效率更高，这表明宿主因素可能影响 CAST 系统的转座效率。
4. 控制VpaCAST 系统表达的启动子在副溶血性弧菌中比在大肠杆菌中更活跃：对VpaCAST 系统相关启动子在大肠杆菌和副溶血性弧菌中的转录活性进行比较，发现除合成启动子 P*_J23119外，其他启动子在副溶血性弧菌中的活性均高于大肠杆菌，这可能是Vpa*CAST 系统在不同宿主中转座效率差异的原因之一，但还需进一步研究确定。

讨论

CAST 系统是移动遗传元件（MGEs）与细菌防御系统共同进化的创新成果，但目前对其在天然宿主中的运作机制了解有限。本研究首次对副溶血性弧菌 RIMD2210633 中的 CAST I - F3a 系统进行遗传表征，该系统可能在毒力因子传播中起重要作用。研究发现VpaCAST 系统在标准实验室生长条件下转录活跃，但其转录水平是否足以促进转座尚不清楚。

VpxR 在副溶血性弧菌中对相关启动子有调控作用，但之前在大肠杆菌中的研究结果与本研究存在差异，其对非典型 CRISPR 阵列启动子的调控机制还需深入研究。此外，VpaCAST 系统在大肠杆菌中转座效率较低，可能与蛋白和相关序列的差异有关，而在副溶血性弧菌中效率更高，这可能与宿主因素有关，如某些宿主因子可能促进转座过程，未来需进一步鉴定这些因子，这对理解 CAST 系统在塑造弧菌演化中的作用及拓展基于 CAST 的工程工具宿主范围具有重要意义。

材料和方法

1. 菌株、质粒和生长条件：本研究使用了多种大肠杆菌和副溶血性弧菌菌株及相关质粒，详细信息见文中表格。菌株在 LB 培养基或 LB 琼脂平板上培养，根据菌株和质粒类型添加相应抗生素进行筛选，副溶血性弧菌在 30℃培养，大肠杆菌在 37℃培养。
2. RNA 纯化和 cDNA 合成：从副溶血性弧菌野生型和tniQ启动子突变株的指数生长期细胞中提取 RNA，使用商业试剂盒进行 RNA 纯化和 DNA 酶 I 处理，然后以处理后的 RNA 为模板合成 cDNA，通过 RT - PCR 半定量分析基因表达，并用 Image Lab 软件进行 DNA 条带密度分析。
3. 遗传构建体的生成：使用高保真 DNA 聚合酶 Q5 通过 PCR 扩增产生用于构建遗传构建体的扩增子，利用相关试剂盒进行 PCR 产物纯化和质粒分离，通过 Sanger 测序验证构建体的准确性。构建体包括转录融合构建体、过表达构建体、用于基因编辑的质粒等，具体构建方法如文中所述。
4. 发光测定：按照之前描述的方法进行浮游培养物的发光测定，将过夜培养的菌液稀释后培养至特定光密度，转移至 96 孔板，用酶标仪检测发光情况，计算相对发光单位（RLU） 。
5. VpxR 假定结合位点的共有序列标识生成：使用 MEME 算法，对vpxR及其同源基因的上游序列和非典型 CRISPR 阵列相关序列进行分析，生成保守基序及其共有序列标识。
6. INTEGRATE 系统中重编程 CRISPR 阵列的生成：设计靶向间隔序列，通过退火形成寡聚双链，磷酸化后与经 BsaI - HFv2 酶切的质粒连接，构建重编程的 CRISPR 阵列。
7. INTEGRATE 介导的转座测定：通过三亲本杂交将相关质粒转移至大肠杆菌和副溶血性弧菌菌株，在含有相应抗生素的平板上筛选转接合子，对于分析转座事件，在平板中添加 X - gal 和 IPTG，通过蓝白菌落计数和 PCR 分析转座情况。