基于四面体 DNA 的 CRISPR/Cas12a 免扩增电化学发光生物传感器：超灵敏检测具核梭杆菌的新利器

具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）的 fadA 基因是结直肠癌早期诊断的生物标志物。为解决现有 CRISPR/Cas 传感器的问题，研究人员开发免扩增电化学发光（ECL）生物传感器检测具核梭杆菌。该传感器检测范围广、灵敏度高，有望用于结直肠癌早期诊断。

　　在健康医学领域，结直肠癌（CRC）如今已成为最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的生命健康。与健康人相比，CRC 患者肠道黏膜和粪便样本中的细菌多样性明显降低，其中具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）在 CRC 的发展过程中扮演着 “帮凶” 的角色。具核梭杆菌能分泌多种毒力因子，其携带的 fadA 基因编码的 Fusobacterium adhesin A（FadA），在 CRC 患者粪便宏基因组中含量升高，它能与 CRC 细胞表面的钙粘蛋白紧密结合，帮助具核梭杆菌 “赖” 在癌细胞上，躲避人体免疫系统的 “追捕”，加速肿瘤的发生。因此，精准检测粪便样本中具核梭杆菌的 fadA 基因，成为了 CRC 早期诊断的关键，对提高患者的生存率至关重要。

目前，基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的诊断方法因高灵敏度、高特异性和可靠性备受关注。其中，CRISPR/Cas12a 系统可在无需逆转录的情况下检测 DNA，激活后能非特异性切割单链 DNA（ssDNA），实现信号放大。然而，现有的基于 CRISPR/Cas 的传感器存在诸多问题，比如探针容易纠缠或局部聚集，使得 Cas 酶的效率大打折扣，就像原本畅通的道路被堵住了，车辆（反应）自然无法顺利通行。

为了攻克这些难题，推动 CRC 早期诊断技术的进步，来自未知研究机构的研究人员开展了一项极具创新性的研究。他们成功开发了一种基于 CRISPR/Cas12a 的免扩增电化学发光（ECL）生物传感器，用于超灵敏检测具核梭杆菌的 fadA 基因，相关研究成果发表在《Cyborg and Bionic Systems》上。

研究人员在这项研究中主要运用了以下关键技术方法：一是构建、表达和纯化 AsCas12a，通过一系列操作获得高纯度的 AsCas12a 蛋白；二是设计并合成靶向 fadA 基因的 CRISPR RNA（crRNA），引导 AsCas12a 识别目标序列；三是制备四面体 DNA 纳米结构（TDN），其独特的结构为后续实验提供了稳定且高效的平台；四是利用电化学沉积法在电极表面修饰珊瑚状金（CFAu），优化传感器性能。

在研究成果方面：

• CRISPR/Cas12a 系统的表征与验证：研究人员成功构建了 pET28a - AsCas12a 质粒，并诱导表达出高纯度的 AsCas12a 蛋白。设计的 crRNA 能与 fadA 基因精准结合，激活 AsCas12a 的反式切割活性，有效切割非目标 ssDNA 报告分子。实验表明，只有当 AsCas12a、crRNA 和 fadA 基因同时存在时，才能观察到明显的切割现象，这就像是一把特制的 “剪刀”（AsCas12a/crRNA），只有遇到特定的 “绳子”（fadA 基因）才会发挥切割作用。
• TDN - ssDNA 和 CFAu 的制备与表征：TDN - ssDNA 由四条单链 DNA 通过碱基互补配对形成，其特殊结构不仅能防止探针脱落，还能提高物质传输效率，为 AsCas12a/crRNA 与 ssDNA 探针的相互作用创造了有利条件。CFAu 具有较大的比表面积和良好的生物相容性，能有效固定核酸探针，加速电子转移。通过扫描电子显微镜（SEM）、循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）等技术对其进行表征，结果显示 CFAu 修饰的电极性能得到显著提升。
• fadA 的荧光分析特异性检测：通过优化 AsCas12a/crRNA 的反式切割时间、二者比例、Mg^{2 +}浓度以及荧光探针 ssDNA - FQ 浓度，确定了最佳检测条件。在该条件下，fadA 浓度与荧光强度在一定范围内呈现良好的线性关系，证明了该系统对 fadA 检测的特异性和有效性。
• ECL 生物传感器的灵敏度性能：优化了 ECL 检测中的关键条件，如三丙胺（TPA）和二茂铁羧酸（Fc - COOH）的浓度。实验表明，基于 TDN - ssDNA 修饰的 ECL 生物传感器检测 fadA 的性能更优，检测范围为 10^?5至 100 nM，比荧光检测方法更灵敏，检测限可低至飞摩尔级别。
• 免扩增 ECL 生物传感器对具核梭杆菌的超灵敏检测：无论是荧光分析还是 ECL 检测，都显示出该方法对具核梭杆菌的检测具有高灵敏度，ECL 检测的线性范围为 1 至 10⁸ CFU/ml，最低检测限可达 1 CFU/ml，远超其他已报道的检测方法。
• 免扩增 ECL 生物传感器的稳定性和选择性：该生物传感器能准确区分具核梭杆菌与其他细菌，对 PAM 区域附近的单核苷酸错配具有高灵敏度，可有效区分野生型和突变型序列。同时，该传感器在 40 天的存储期内稳定性良好，波动小于 10%。

综上所述，研究人员开发的基于 CRISPR/Cas12a 的 ECL 生物传感器，凭借 AsCas12a 酶激活时的信号放大效应、crRNA 的可编程性以及对目标识别的高特异性，实现了对具核梭杆菌的超灵敏检测，甚至能检测到单菌落水平的具核梭杆菌，且无需基因扩增。该传感器检测 fadA 的范围为 10 fM 至 100 nM，检测具核梭杆菌的范围为 1 至 10⁸ CFU/ml，性能优于传统荧光检测方法。此外，它还具有高选择性和良好的稳定性，在复杂环境样本中能精准检测具核梭杆菌，为 CRC 的体外诊断带来了新希望。而且，该方法可通过合理设计 crRNA 序列，用于检测其他核酸和病原体，有望推动生物传感器的发展，完善疾病早期诊断体系，为人类健康事业做出重要贡献。