新型Rosette-MACS联用技术高效分离肺癌浸润性髓系来源抑制细胞及其功能验证

本研究针对肿瘤微环境(TME)中髓系来源抑制细胞(tMDSCs)分离纯度低、活性差的难题，创新性地将RosetteSep技术与MACS联用，从非小细胞肺癌(NSCLC)组织中获得高纯度(79.64%)、高活性的tMDSCs。通过基因表达谱分析(ARG1/IDO1/PD-L1等)和T细胞增殖抑制实验，证实该方法优于传统FACS/MACS技术，为研究tMDSCs介导的免疫抑制机制提供了可靠技术平台。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，髓系来源抑制细胞(MDSCs)犹如潜伏在肿瘤微环境(TME)中的"特洛伊木马"。这些细胞通过精氨酸酶1(ARG1)、一氧化氮合酶2(NOS2)等分子机制，耗竭T细胞必需的氨基酸，构建起免疫抑制的"铜墙铁壁"。尤其在非小细胞肺癌(NSCLC)中，肿瘤浸润性MDSCs(tMDSCs)与循环MDSCs存在显著差异，但传统分离方法如磁珠分选(MACS)纯度仅0.39%，流式分选(FACS)也仅13.30%，且细胞活性和功能难以保障，成为研究tMDSCs免疫逃逸机制的"卡脖子"难题。

为解决这一技术瓶颈，西班牙巴伦西亚La Fe健康研究所等机构的研究团队创新性地将RosetteSep人白细胞抗原(HLA)髓系细胞富集技术与MACS联用，开发出Rosette-MACS分离方案。该研究通过对14例NSCLC患者的新鲜肿瘤组织进行对比实验，证明新方法可获得79.64%纯度的CD33⁺CD11b⁺HLA-DR^low/- tMDSCs，细胞产量达1800万/克组织，存活率高达89.33%，相关成果发表于《Scientific Reports》。

关键技术包括：1)采用患者自体红细胞补充肿瘤消化液，解决RosetteSep技术依赖红细胞的关键问题；2)通过HLA-DR磁珠负选结合CD33⁺标志富集tMDSCs；3)运用qRT-PCR检测ARG1、IDO1等10个免疫抑制相关基因；4)建立CFSE标记的CD8⁺ T细胞共培养增殖抑制实验验证功能。

研究结果显示：
"Setup of tMDSCs isolation using RosetteSep and MACS combination"部分证实，通过1:1比例混合自体红细胞与肿瘤消化液，成功将RosetteSep技术适配于实体瘤样本，解决了传统密度梯度离心无法区分中性粒细胞与PMN-MDSCs的缺陷。

"Comparison of FACS, MACS and Rosette-MACS approaches"通过六组平行实验证明，新方案处理时间(200分钟)介于FACS(240分钟)与MACS(170分钟)之间，但细胞回收率提升40倍，纯度较FACS提高6倍。流式细胞术显示CD33⁺CD11b⁺HLA-DR^low/-群体占比达79.64%，远超对照方法。

"Characterization of tMDSCs isolated by the Rosette-MACS method"部分发现，分离的tMDSCs高表达免疫抑制相关分子：ARG1 mRNA水平较健康人外周血单个核细胞(PBMCs)升高94倍，PD-L1表达增加38倍。功能实验显示，tMDSCs能以1:2比例显著抑制CD8⁺ T细胞增殖(抑制率35.03% vs 57.21%)。

讨论部分指出，该技术突破有三重意义：首先，首次实现从人肺肿瘤组织高效分离功能性tMDSCs，解决了PBMCs来源MDSCs不能真实反映TME状态的局限；其次，通过LOX-1、S100A8/A9等新型标志物的同步检测，为区分PMN-MDSCs与中性粒细胞提供了新思路；最后，建立的基因表达谱-功能验证双平台，为靶向MDSCs的免疫治疗药物筛选奠定了基础。

研究也存在一定局限：需依赖新鲜肿瘤样本和自体红细胞，且仅适用于CD33⁺髓系细胞富集。未来可通过建立红细胞冻存方案、开发非红细胞依赖型RosetteSep试剂加以改进。该工作为探索TME中MDSCs与肿瘤细胞的"对话"机制提供了关键技术支撑，对发展联合MDSCs靶向策略的肺癌免疫治疗方案具有重要价值。