新型链特异性定量 PCR 检测技术揭示禽呼肠孤病毒不同毒株复制差异

这篇研究论文聚焦禽呼肠孤病毒（ARV）。目前常用检测方法存在缺陷，研究人员开发出链特异性定量 PCR（SS-qPCR）技术，能精准量化 ARV 基因组，避免传统 qPCR 的高估问题，还发现不同 ARV 毒株与细胞关联的差异，为研究 ARV 提供新工具。

　　

引言

禽呼肠孤病毒（ARV）属于正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）、双 RNA 病毒科（Spinareoviridae） ，是一种普遍存在的双链 RNA（dsRNA）病毒，能感染野生和家养禽类，给家禽业带来严重威胁。ARV 基因组由 10 个片段组成，编码多种蛋白。感染禽类后症状多样，从无症状到严重发病甚至死亡，如出现水样粪便、淋巴器官萎缩、肝坏死等，其中病毒性关节炎和腱鞘炎是其特征性症状。尽管采取了生物防控和疫苗接种措施，过去 20 年致病性 ARV 野外分离株仍在增加，促使人们深入研究其致病的分子机制。

在病毒研究中，准确量化病毒至关重要。当前，ARV 病毒量常用 50% 组织培养感染剂量（TCID₅₀）表示，但该方法无法提供样本中病毒基因组数量或活病毒粒子数的具体信息。相较于 TCID₅₀，噬斑实验更适合测定活病毒粒子数，而实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）则更适用于研究基因表达和核酸丰度。传统 RT-qPCR 在检测双链 RNA 病毒时，会因正（+）义 RNA 的过量存在而产生偏差，导致病毒数量高估，因此需要开发一种新的分子方法来准确量化 ARV 基因组。

结果

1. 检测 ARV 基因组的链特异性 RT-qPCR 检测方法：为设计 SS-qPCR 检测方法的引物，研究人员对 55 株 ARV 的 M3 基因组片段进行比对，发现μNS基因中靠近 5′端的一段 16 - 161bp 区域在所有检测分离株中相似度超 97%，基于此设计了 20bp 的正向和反向引物，预期扩增产物为 146bp。为特异性靶向 ARV 基因组的负（-）义 RNA 链，在正向引物 5′端添加了一段 33bp 的独特标签。该检测方法先进行短变性和退火步骤形成标签 - cDNA 杂交链，随后的 RT-qPCR 步骤使用针对独特标签和 ARV 反向特异性引物进行扩增和定量。

以 ARV-s1133 Ft. Dodge 毒株为例对检测方法进行表征，通过 10 倍系列稀释表达载体生成标准曲线，结果显示该检测方法的检测限为每个 PCR 反应 200 个基因组拷贝，在第 32 个循环达到峰值，反应效率为 96.2%。对家禽环境样本的检测表明，该方法能有效区分感染样本、未感染样本和无模板对照样本，且琼脂糖凝胶电泳验证了扩增产物的特异性和长度正确性。

1. SS-qPCR 与传统 RT-qPCR 在 ARV 基因组定量中的比较：研究人员在鸡肝癌细胞（LMH）和鹌鹑纤维肉瘤细胞（QM5）中比较了 SS-qPCR 和传统 RT-qPCR 在 ARV 复制过程中基因组定量的性能。实验选用了 ARV-s1133 Ft. Dodge、野外分离株 ARV-127720（σC 基因群 1）和 ARV-141045（σC 基因群 7）三种毒株感染细胞，并在 5 天内监测其生长情况。

结果显示，在所有观察条件下，传统 RT-qPCR 检测到的（+）链拷贝数均高于 SS-qPCR 检测到的（-）链拷贝数，有时甚至高出 3 - 6 倍。在感染初期（T0），SS-qPCR 检测到的（-）链基因组数量与病毒接种量接近，而传统 RT-qPCR 检测到的（+）链 RNA 数量显著更高。此外，不同毒株在不同细胞系中的复制动力学存在差异，如在 LMH 细胞中，所有毒株在感染 24 小时后病毒基因组拷贝数增加并达到峰值；在 QM5 细胞中，毒株达到峰值的时间比 LMH 细胞晚 2 - 4 天。这些结果表明，SS-qPCR 检测方法能够观察到 ARV 毒株和细胞系之间病毒动力学和复制动态的差异。

1. SS-qPCR 检测方法揭示 ARV 毒株间细胞关联的差异：利用 SS-qPCR 检测方法监测 ARV 与细胞的关联情况。结果发现，时间、样本获取来源（细胞培养上清液或细胞沉淀）以及单个毒株的复制动态都会显著影响通过 SS-qPCR 定量的 ARV 基因组数量。ARV-s1133 Ft. Dodge 和 ARV-127720 在 QM5 和 LMH 细胞中的生长动力学相似，感染后 2 天内，细胞沉淀和上清液中的病毒载量相近，之后细胞沉淀中的病毒数量增多，表明这两种病毒与细胞的关联更强。而 ARV-141045 在感染后，细胞沉淀中的基因组数量与接种量相对保持一致，上清液中的病毒数量呈现典型的病毒生长曲线趋势，说明该毒株与上清液的关联更强。

讨论

目前多数实验室依赖 TCID₅₀和标准 RT-qPCR 来量化病毒基因组和进行分子检测，但这些方法无法深入提供对 ARV 生长动力学研究至关重要的病毒粒子数或基因组拷贝数信息。ARV 在感染细胞的细胞质中复制，会将亚感染性病毒粒子（SIVs）分隔到细胞质新细胞器中，SIVs 保留（-）义和（+）义基因组 RNA 用于病毒复制和基因表达。在病毒复制过程中，新合成的（+）义 RNA 大量产生，起初作为病毒基因表达的 mRNA，随后作为（-）义链合成的模板。由于（+）义 mRNA 的数量可能比（-）义 RNA 多 50 倍，传统 qPCR 在检测双链和（-）链 RNA 病毒时会偏向扩增（+）义 RNA（mRNA），从而干扰病毒基因组的准确量化。

研究人员设计的 SS-qPCR 检测方法，通过靶向 M3 片段上保守的μNS基因，并添加独特的 5′ - 标签，避免了传统 qPCR 对基因组数量的高估问题。与传统 qPCR 相比，SS-qPCR 在每个样本中检测到的基因组拷贝数更低，能更准确地测定 ARV 病毒基因组，避免将病毒基因组片段与用于基因表达的 mRNA 混淆。此外，利用 SS-qPCR 对不同 ARV 毒株与细胞关联的研究发现，ARV-s1133 Ft. Dodge 和 ARV-127720 作为融合性病毒，大部分病毒粒子保留在细胞内；而 ARV-141045 虽然与 ARV-s1133 Ft. Dodge 有相似的负责细胞融合的 p10 FAST 蛋白，但释放到上清液中的病毒粒子更多，与细胞的关联较弱。这表明不同 ARV 毒株的复制动力学存在差异，需要进一步研究 ARV-141045 的表型特征和其与上清液关联的分子机制。总之，SS-qPCR 检测方法可用于密切监测病毒生长动力学，表征链特异性差异，有助于更好地理解 ARV 的分子基础，为体外研究 ARV 复制动力学和病毒生命周期提供更有意义的数据。

材料和方法

1. 引物设计：从 55 株 ARV 的 M3 基因组片段中手动提取μNS核苷酸序列，使用 Geneious Prime 2022.1.1 软件中的 CLUSTAL Omega v1.2.2 进行比对，基于μNS基因的保守区域，利用 Integrated DNA Technologies 公司的 OligoAnalyzer Tool 设计正向和反向引物，引物由 IDT 公司合成。
2. RT-qPCR：使用 Luna Universal qPCR Master Mix（New England BioLabs）、5′ - 标签特异性引物和 3′ - ARV 特异性引物进行 RT-qPCR。反应在 STEP one plus 热循环仪（Thermo Fisher Scientific）中进行，循环条件为 95°C 15s（变性）、60°C 30s（退火）、60°C 30s（延伸）。通过编码全长 5′ - 标签 - ARV 扩增子的质粒生成标准曲线。
3. μNS 质粒和标准曲线构建：为生成 SS-qPCR 标准曲线，使用编码参考菌株 s1133（NCBI 登录号 KF741761.1）146bp muNS 扩增子和 33bp 标签的 T7 RNAP 质粒（Vector Builder）。将质粒在含氨苄青霉素的 LB 肉汤中过夜培养后，使用 Monarch Plasmid Miniprep Kit 进行提取，通过 Nanodrop 1000 分光光度计测定浓度，计算质粒拷贝数并进行 10 倍系列稀释。利用上述 qPCR 检测方法测定每个稀释度的 CT 值，使用 QuantStudio Design and Analysis 软件（v.1.5.3, Applied Biosystems）通过对数₁₀样本量和相应 CT 值的线性回归分析构建标准回归曲线。
4. 细胞：LMH 细胞由美国佐治亚大学的 Holly Sellers 教授馈赠，QM5 细胞由加拿大曼尼托巴大学的 Kevin Coombs 教授馈赠。两种细胞在添加 0.1% 庆大霉素和 8% 胎牛血清的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中，于 37°C、5% CO₂条件下在 T175 培养瓶中常规培养。
5. 病毒：ARV-141045 和 ARV-127720 来自佐治亚大学 Sellers 实验室，ARV-s1133 Ft. Dodge 毒株来自奥本大学 Ruediger Hauck 实验室。将病毒在 LMH 细胞上扩增 5 天后收集，分别收集细胞培养上清液和细胞碎片，超速离心后，将细胞沉淀重悬、超声处理并分装保存于 - 80°C。研究中所用 ARV 的完整基因组序列可在 NCBI 数据库中获取。
6. 生长曲线：将约 80% 汇合的 LMH 和 QM5 细胞用 TrypLE 消化后接种到 24 孔板中，每孔接种 1000 PFU 的 ARV-127720、ARV-141045 或 ARV-s1133 Ft. Dodge。在接种后立即（T0）及之后的 5 天内每天收集细胞和培养基，用于比较传统 qPCR 和链特异性 qPCR 检测到的基因组数量差异。同时，将收集的细胞和培养基离心，分别收集细胞沉淀和上清液，用于检测 ARV 基因组拷贝数的差异。
7. RNA 提取和 cDNA 合成：使用 Trizol 试剂（Thermo Fisher Scientific）按照制造商的方案提取病毒 RNA，将 RNA 变性、退火后，使用 iScript cDNA 合成试剂盒（BIO-RAD）将其转化为 cDNA。使用 NanoDrop 1000 分光光度计对 cDNA 进行定量并稀释后，用于传统 RT-qPCR 和 SS-qPCR 检测。
8. 统计分析：基于循环阈值与标准曲线比较计算 SS-qPCR 检测的病毒基因组数量。实验设置技术重复和生物学重复，使用 R v4.2.2 统计软件进行分析，对数据进行对数转换，采用具有自回归 1（AR-1）协方差结构的模型拟合，以校正重复测量数据。使用 Holm 校正计算比较的 P 值（调整后的 P 值） 。