Hi-TARGET：开启嗜热产乙酸菌基因组编辑新时代，助力工业生物制造

在工业生物技术领域，嗜热产乙酸菌 Thermoanaerobacter kivui 潜力巨大，但现有基因组编辑工具存在局限。研究人员开发 Hi-TARGET 工具，其编辑效率高且功能多样。这一成果加速菌株开发，推动相关研究和工业生产。

　　在工业生物技术的舞台上，嗜热微生物正逐渐崭露头角。其中，嗜热产乙酸菌 Thermoanaerobacter kivui 凭借其独特的 “技能”，成为了科研人员眼中的 “潜力股”。它能在高温环境下，高效地利用 CO₂、CO 和 H₂等物质快速生长，就像一台小小的 “绿色工厂”，在循环碳经济中，有着将 C1 平台原料转化为高附加值产品的巨大潜力，比如生产乙醇、丙酮和异丙醇等。然而，这台 “工厂” 想要更好地运作，却面临着一个关键难题 —— 缺乏高效的 “改造工具”。目前针对 Thermoanaerobacter kivui 的基因组编辑工具，在速度和效率方面存在明显不足，就像钝了的刀具，难以精准、快速地对其基因组进行改造，这大大限制了它在工业应用中的发展，也阻碍了科研人员对其深入研究。

为了攻克这一难题，来自奥地利维也纳技术大学（Technische Universit?t Wien）的研究人员 Angeliki Sitara、Rémi Hocq 等人展开了一场科研攻关。他们致力于开发一种高效、通用的基因组编辑工具，期望能为 Thermoanaerobacter kivui 的研究和应用开辟新道路。最终，他们成功研发出 Hi-TARGET（High-efficiency Thermoanaerobacter kivui CRISPR genome editing tool），这一成果发表在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》上，为该领域带来了新的曙光。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先，通过生物信息学工具（如 CRISPRCasFinder、CRISPRTarget）对 Thermoanaerobacter kivui 的内源性 CRISPR 系统进行分析，精准定位关键元件。其次，利用 Golden Gate 组装技术构建质粒，实现基因编辑载体的快速组装。此外，通过优化转化和筛选流程，提高了转化效率和编辑效果，确保实验的顺利进行。

下面让我们来看看具体的研究结果：

1. Thermoanaerobacter kivui 的内源性 CRISPR 系统：研究人员利用 CRISPRCasFinder 工具发现 Thermoanaerobacter kivui 基因组包含多个 CRISPR 阵列和 Cas 系统，选择其中一个 Type I-B CRISPR 阵列深入研究。通过分析，确定了合适的 PAM（protospacer-adjacent motif）序列为 CCN，且验证了该系统的活性，为后续编辑工作奠定了基础。
2. 转化效率的提升：针对 Thermoanaerobacter kivui 原本较低的转化效率，研究人员对转化方案进行优化。他们更换了固化剂，调整了 plating volume 和温度，成功将转化效率提高了 245 倍，达到 1.96×10⁴±8.7×10³ CFU μg^-1 ，大大提高了实验效率。
3. 基因组编辑的实现：研究人员构建了多个基因组靶向载体，对 Thermoanaerobacter kivui 的基因进行编辑。实验结果令人惊喜，基因敲除（如 pyrE、rexA、hrcA）和敲入（ldh::pFAST）的效率均达到 100%，点突变（PolC^C629Y ）的效率为 49%。而且，他们发现即使直接使用 Golden Gate 组装的克隆混合物作为 DNA 输入，也能成功实现基因组编辑，展现了 Hi-TARGET 的高效性和便捷性。
4. 基因功能的研究：研究人员利用 Hi-TARGET 对 rexA 和 hrcA 基因进行编辑，研究其功能。结果发现，hrcA 基因缺失突变体在生长表型上没有明显变化；而 rexA 基因作为转录调节因子，负向调控乳酸脱氢酶（ldh）的表达，这一发现为深入了解 Thermoanaerobacter kivui 的代谢调控机制提供了重要线索。
5. 编辑菌株的处理：为了获得纯净的编辑菌株，便于后续多轮基因组编辑，研究人员开发了更严格的固化方案。实验表明，缩短同源臂（HAs）长度能显著减少获得固化菌株所需的时间，提高了菌株开发效率。
6. 其他编辑应用：Hi-TARGET 还成功实现了在 Thermoanaerobacter kivui 中引入单核苷酸突变、整合荧光标记（pFAST）以及通过缩短 crRNA 实现基因下调（如对 pFAST 基因），充分展示了该工具的多功能性。

研究结论和讨论部分指出，Hi-TARGET 作为一种高效、通用的基因组编辑方法，基于 Thermoanaerobacter kivui 的内源性 Type I-B CRISPR 系统开发而来。它不仅能够实现多种类型的基因编辑，而且编辑效率高、速度快，能在短时间内获得纯净的编辑菌株。与其他同类研究相比，Hi-TARGET 在编辑效率和时间成本上具有明显优势，即使与生长快速的模式生物大肠杆菌相比，其基因组编辑效率也毫不逊色。虽然 CRISPR - based 基因组编辑可能存在脱靶效应，但 Hi-TARGET 在使用短至 11bp 的间隔序列时，并未出现明显的细胞死亡等脱靶问题。这一研究成果对于深入理解产乙酸菌的代谢机制具有重要意义，为进一步开发利用 Thermoanaerobacter kivui 生产绿色化学品和燃料提供了有力工具，有望推动工业生物技术领域的发展，助力实现可持续发展目标。