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在作物育种中，培育无转基因的基因编辑植物是一大挑战。研究人员利用 CRISPR/Cas9-RNP 复合物转染胡萝卜原生质体开展研究。结果成功获得无转基因编辑的胡萝卜植株，这为培育无转基因编辑作物提供了有效方法。
在农业领域，胡萝卜（Daucus carota L. subsp. sativus Hoffm.,
2n=2x=18 ）作为重要的世界蔬菜作物，是人们膳食中维生素 A 原的主要来源。随着新植物育种技术的不断发展，在短时间内培育出具有理想性状的作物新品种已成为可能。其中，CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列 / CRISPR 相关蛋白）基因组编辑技术在作物改良和粮食生产方面展现出巨大潜力。然而，将基因组编辑技术应用于作物育种时，培育无转基因的基因编辑植物却面临着重重挑战。
以往常用的实现无转基因编辑植物的策略，要么通过遗传分离去除稳定整合的 CRISPR/Cas9 表达构建体，这一过程耗时漫长；要么让细胞短暂暴露于编辑试剂，但此前将 Cas9/sgRNA RNP 复合物导入胡萝卜原生质体后再生编辑植株的方法尚未见报道。在此背景下，美国威斯康星大学麦迪逊分校（University of Wisconsin-Madison）的研究人员开展了相关研究，致力于解决这一难题。
研究人员以胡萝卜的酸溶性转化酶同工酶 II 基因（GenBank 登录号 Y18706.1）为靶点开展研究。该基因负责将蔗糖分解为果糖和葡萄糖等游离糖，研究人员推测通过基因编辑使该基因失活，有望让蔗糖在胡萝卜的可食用肉质根中积累。他们设计了两种靶向该基因第 3 外显子的 sgRNA（sgRNA1 和 sgRNA2） ，并将 Cas9/sgRNA RNP 复合物转染到胡萝卜原生质体中，随后使植株再生。
在研究过程中，研究人员运用了多项关键技术方法。首先是设计合成 sgRNA，通过体外转录等技术获得用于实验的 sgRNA 分子；然后将合成的 sgRNA 与 Cas9 蛋白等组装形成 RNP 复合物；利用聚乙二醇（PEG）介导转染技术，将 RNP 复合物导入胡萝卜原生质体；最后借助组织培养技术，使转染后的原生质体再生为完整植株。
研究结果显示，共从转染了含 sgRNA1 和 sgRNA2 的 RNP 复合物的原生质体中分别再生出 81 株和 31 株植株。经检测，sgRNA1 复合物转染再生植株的编辑率为 17.28%（81 株中有 14 株） ，sgRNA2 靶向区域的编辑率为 6.45%（31 株中有 2 株）。通过桑格测序（Sanger sequencing）及 DECODR 软件分析发现，编辑后的植株中，有 3 株为纯合突变，5 株为双等位基因突变，8 株为杂合或嵌合突变。这些突变主要为单碱基插入或 1 - 9nt 的小缺失。并且编辑后的植株生长发育正常。
研究结论表明，研究人员成功利用 Cas9/sgRNA RNP 转染技术，从原生质体中培育出了无转基因编辑的胡萝卜植株。这一成果意义重大，为在胡萝卜基因组中编辑具有重要农艺性状的基因提供了有效方法，也展示了该方法在创建无转基因基因组编辑胡萝卜植株方面的潜在应用价值。未来，研究人员还将进一步探索这些突变对胡萝卜植株糖代谢的影响，有望为胡萝卜品质改良提供更深入的理论依据和技术支持。此项研究成果发表在《Plant Cell Reports》上，为作物育种领域的研究开辟了新的思路，也为其他科研人员在相关领域的研究提供了重要的参考范例 ，推动了植物基因编辑技术在农业生产中的应用进程。
