编辑推荐：
为解决艰难梭菌（Clostridioides difficile）基因研究中对依赖抗生素维持系统的依赖问题，研究人员开发了一种无需抗生素维持的双质粒 CRISPRi 系统。该系统可实现对关键基因如walA的敲低，有助于深入探究艰难梭菌的致病机制，为相关研究开辟新路径。
研究开发出一种用于艰难梭菌（
Clostridioides difficile）的双质粒 CRISPRi（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats interference）系统，该系统无需抗生素维持。其中，pJAK184.tetR.PT5 - 3.dCas9 质粒含有经优化的四环素诱导型无催化活性的 Cas9（dCas9
），可整合到艰难梭菌染色体上。pJC.15A.sgRNA.TA 质粒编码毒素 - 抗毒素系统用于稳定维持，还带有 mCherry，其可替换为定制的 sgRNA（single - guide RNA）。通过实验证明，该系统能够实现对必需基因 walA 的敲低。
构建质粒时，运用了 Gibson 组装和体内重组技术。将 pJAK184.tetR.PT5 - 3.dCas9 质粒导入艰难梭菌 R20921 并整合到杆菌肽通透酶基因下游，经测序确认插入正确。对 pJC.15A.sgRNA.TA 质粒用 BsmBI 酶切后，插入靶向 walA 或随机对照的 sgRNA，再导入含 dCas9 的艰难梭菌。结果显示，靶向 walA 的菌株在诱导时生长明显受抑制，未诱导时生长正常，而阴性对照无论是否诱导，生长都与野生型相似。这一系统稳定且能在无诱导情况下敲低必需基因，还避免了抗生素筛选带来的潜在影响 。
