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在重复扩增疾病（REDs）研究中，研究人员为探究 MSH2 在脆性 X 综合征（FXS）和弗里德赖希共济失调（FRDA）中对 DNA 甲基化的作用，敲除相关细胞系的 MSH2 基因。结果发现，MSH2 缺失不影响 FXS 和 FRDA 中 DNA 甲基化，还发现转录诱导的重复收缩现象。这为疾病机制研究和治疗提供新方向。
在生命的奥秘长河中，基因就像精密的 “代码”，掌控着人体的各种机能。然而，有些基因会出现 “异常代码”，导致疾病发生。重复扩增疾病（REDs）便是这样一类由基因中短串联重复序列扩张引发的病症，目前已知有超 50 种，它们就像隐藏在基因里的 “小恶魔”，严重影响人类健康。
脆性 X 综合征（FXS）是一种 X 连锁神经发育障碍疾病，罪魁祸首是 Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1（FMR1）基因 5’非翻译区（UTR）的 CGG 三核苷酸重复序列扩张。正常情况下，FMR1 基因携带 6 - 54 个 CGG 重复序列，当重复数超过 200 时，基因启动子及重复区域会发生高甲基化，致使转录沉默，重要的 RNA 结合蛋白 Fragile X Messenger Ribonucleoprotein（FMRP）缺失，进而引发智力障碍。弗里德赖希共济失调（FRDA）则是一种常染色体隐性进行性神经退行性疾病，是 frataxin（FXN）基因内含子 1 中的 GAA 重复序列扩张所致。正常 FXN 基因含 7 - 33 个 GAA 重复序列，患者体内该重复序列可达到 66 - 1700 个，这会影响转录起始和延伸，减少 frataxin 蛋白表达。此外，在肌强直性营养不良 1 型（DM1）中，研究发现 MutS homolog 2（MSH2）参与维持 Dystrophy Myotonic Protein Kinase（DMPK）基因启动子区域的 DNA 甲基化。鉴于 MSH2 在 DM1 中的作用，以及 FXS 和 FRDA 患者基因中重复序列扩张常伴随 DNA 损伤，研究人员猜测 MSH2 可能也参与维持 FXS 和 FRDA 中重复序列诱导的 DNA 甲基化。为解开这个谜团，美国国立糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health）的 Jessalyn Grant - Bier、Kathryn Ruppert 等研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Epigenetics & Chromatin》杂志上。
研究人员主要运用了 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，构建了 MSH2 基因敲除（KO）的 FXS 胚胎干细胞（ESCs）和 FRDA 诱导多能干细胞（iPSCs）细胞系；还使用了甲基化特异性 qPCR、亚硫酸氢盐测序等技术检测 DNA 甲基化水平，利用 PCR 分析 CGG 和 GAA 重复序列长度。实验样本来源于纽约威尔康奈尔医学院的 FXS ESCs（WCMC37）和科里尔医学研究所的 FRDA iPSCs（GM23404） 。
MSH2 缺失对 FXS 中 FMR1 启动子 DNA 甲基化的影响
研究人员首先确认了 FXS ESCs（WCMC37F）中 CGG 重复序列大小、启动子甲基化状态及 FMR1 基因转录情况。随后，利用 CRISPR/Cas9 技术敲除 MSH2 基因，构建 MSH2 KO 的 FXS ESCs 细胞系，并设置 MSH2 野生型（WT）对照细胞系。经过至少 100 天培养，分析 FMR1 mRNA 水平、DNA 甲基化和 CGG 重复序列大小。结果发现，MSH2 KO 和 WT 细胞系中 FMR1 mRNA 水平均无显著变化，DNA 甲基化水平也无明显差异，表明 MSH2 缺失不影响 FXS ESCs 中 FMR1 启动子的整体 DNA 甲基化水平。
MSH2 缺失对 FRDA 中 FXN 基因座 DNA 甲基化的影响
考虑到 DMPK 基因与 FMR1 基因的 CpG 密度不同，研究人员选取了 FRDA 进行研究，因其 FXN 基因中扩张的 GAA 重复序列上游差异甲基化区域的 CpG 含量较低。研究人员构建了 MSH2 KO 的 FRDA iPSCs 细胞系和 WT 对照细胞系，培养至少两个月后检测发现，MSH2 缺失不影响 FXN mRNA 水平，且 MSH2 KO 和 WT 细胞系中 DNA 甲基化水平无显著差异，说明 MSH2 缺失对 FRDA iPSCs 中 FXN 基因座的 DNA 甲基化无明显影响。
MSH2 在 FMR1 等位基因从头甲基化中的作用
此前研究表明，MSH2 在 DM1 中不参与从头甲基化，但在 FXS 和 FRDA 中其作用尚不明确。研究人员尝试通过瞬时表达 ten - eleven translocation 1（TET1）重新激活 FMR1 基因来探究 MSH2 的作用。结果发现，转染 dCas9 - TET1 后，FMR1 基因重新激活，同时出现大量 CGG 重复序列收缩，且部分收缩不依赖 MSH2，这使得研究 MSH2 在从头甲基化中的作用变得困难。
在讨论部分，研究人员指出，不同 REDs 在维持重复序列上游 DNA 甲基化的机制上存在差异，MSH2 并非 FXS 和 FRDA 中维持 DNA 甲基化所必需的因素，这与 DM1 中的情况不同，且这种差异不能归因于 GC 含量或 CpG 密度。此外，转录可驱动至少两种类型的 CGG 重复序列收缩，其中部分收缩不依赖 MSH2，这可能与疾病的临床表型变异有关。
总的来说，该研究打破了传统认知，揭示了 MSH2 在不同 REDs 中的不同作用机制。研究表明，MSH2 在 FXS 和 FRDA 中不参与维持 DNA 甲基化，转录诱导的重复收缩现象为理解疾病机制和开发治疗方法提供了新视角。这一研究成果为后续深入探究 REDs 的发病机制和寻找潜在治疗靶点奠定了重要基础，有望推动相关疾病治疗手段的创新与发展。
