揭秘枯草芽孢杆菌中新型 Turnagainolides 及其生物合成基因簇：拓展环肽化学多样性与药用潜力研究

本文从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）LP 中发现 4 种新型 Turnagainolide 同系物及 2 种已知化合物，通过多种技术鉴定结构，确定其生物合成基因簇（tur-BGC）并提出合成途径，还发现其具有生物膜抑制和细胞毒性等活性，为相关研究提供重要依据。

　　

引言

微生物天然产物因多样的生物活性和复杂结构，成为新药研发的宝贵资源。然而，将微生物天然产物与其生物合成基因簇关联起来颇具挑战，这阻碍了对其的开发利用。截至 2024 年，大量微生物天然产物已被发现，但与之相关的生物合成基因簇在数据库中记录较少，迫切需要深入探索。

Turnagainolides 是一类独特的环肽，含有（E）-3 - 羟基 - 5 - 苯基戊 - 4 - 烯酸（Hppa）和 4 种蛋白质氨基酸。从海洋真菌、芽孢杆菌、节杆菌和链霉菌等多种微生物中均有发现，且具有多种生物活性，如激活 SHIP1 酶、抑制群体感应、抗菌等。但该类物质的生物合成基因簇一直未被明确，本研究旨在填补这一空白。

结果

1. Turnagainolides 的鉴定：从中国西沙采集的海绵样本中分离出菌株 LP，经 16S rRNA 基因分析确定为枯草芽孢杆菌。通过 LC-MS 分析发酵提取物，发现一系列具有特征性紫外吸收和离子模式的峰。利用半制备高效液相色谱和硅胶柱对化合物进行分离纯化，得到 6 种纯化合物，分别为 Turnagainolide A（1）、B（2）、D（3）、E（4）、F（5）、G（6），其中 1、2 为已知化合物，3 - 6 为新型化合物。
   • 通过高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）、核磁共振（NMR）等技术对化合物结构进行解析。以 Turnagainolide D（3）为例，其分子式为 C??H??O?N?，13C、HSQC NMR 数据分析表明含有特定类型的碳，1H NMR 谱显示存在单取代苯环和酰胺 NH 质子等。综合 COSY、HSQC 和 HMBC 数据确定了其氨基酸残基连接顺序和 Hppa 单元的存在，并通过 LC-MS/MS 分析证实结构。
   • Turnagainolide E（4）与 3 结构相似，仅 Ala - 3 被 Gly - 3 取代；Turnagainolide F（5）因样品量不足，结合 1H、COSY NMR 和 LC-MS/MS 分析，确定与 4 相似，只是 Val - 4 被 Ile - 4 取代；Turnagainolide G（6）与 3 相比，Hppa - 1 残基中 C - 4 和 C - 5 之间双键还原且 Val - 4 被 Ile - 4 取代。
   • 采用 Marfey’s 分析确定氨基酸构型，发现多数氨基酸为l - 构型，Ala - 3 在 1 - 3 中为d - 构型。利用 Mosher 酯分析确定 Hppa 残基中 C - 3 构型，在 2 - 4 中为S构型，因样品量限制，5 和 6 中未确定。
   
   
2. Turnagainolide 生物合成基因簇（BGC）的鉴定：对枯草芽孢杆菌 LP 进行基因组测序，用 anti - SMASH 预测次级代谢产物 BGC，发现 12 个基因簇。根据 Turnagainolides 结构特点，推测其通过多模块非核糖体肽合成酶（NRPS）途径合成。经生物信息学分析，确定一个 22,529 bp 的基因簇，包含 8 个开放阅读框（ORFs），命名为 BGC - tur。
   • 其中tur1和tur3 - 8编码 5 个 NRPS 模块和 1 个 II 型聚酮合酶（PKS）模块，其腺苷化结构域底物特异性与 Turnagainolides 中氨基酸残基相符。
   • 通过 CRISPR/Cas9 - 基于的同源重组敲除tur7基因，HPLC 分析显示突变株发酵提取物中无 Turnagainolides，证实tur簇对其生物合成至关重要。对比tur簇编码蛋白与 NCBI 非冗余蛋白数据库，发现同源序列主要分布在芽孢杆菌属。
   • 根据 BGC - tur组装线与化合物结构的共线性关系，提出 Turnagainolide A 的生物合成途径。首先，l - 苯丙氨酸在组氨酸氨裂解酶（tur2）作用下脱氨生成肉桂酸，肉桂酸经 AMP 依赖的合成酶和连接酶（tur1）激活并加载到 KSα 结构域（tur5），同时丙二酰 - CoA 在未知酰基转移酶结构域作用下转移到 ACP 结构域（tur4），KSα 结构域介导肉桂酸与丙二酰 - CoA 缩合。酮还原酶（KR）结构域可能决定 Hppa 中 C - 3 构型。NRPS 模块按顺序添加 Val - 2、X - 3、Ile - 4 和 Val - 5，模块 3 中的差向异构酶（E）结构域促使d - 氨基酸掺入，与 1 - 3 中d - Ala 的存在相符。最后，Tur8 中的硫酯酶（TE）结构域催化线性肽链释放和环化，形成大环内酯环。
   
   
3. 生物活性测定：Turnagainolides 被报道可抑制金黄色葡萄球菌群体感应信号，由于生物膜形成受群体感应调控，因此评估了所鉴定 Turnagainolides 的抗生物膜活性。结果显示，化合物 1 在 400 μg/mL 浓度下表现出弱抑制活性，化合物 2 和 3 在浓度高于 100 μg/mL 时抑制作用稍强。此外，细胞毒性试验表明，化合物 4 对小鼠肿瘤细胞系 BV2 和 MB49 具有显著细胞毒性，IC??值分别为 57.0 μM 和 88.6 μM。

讨论

微生物天然产物是药物研发的丰富资源，但低产量限制了其研究和应用。尽管测序技术和基因工程发展助力了部分微生物天然产物生物合成途径的解析，但已发现的生物合成基因簇仍占比很少。本研究聚焦于 Turnagainolides 生物合成基因簇的鉴定和合成途径的提出，揭示了酶的混杂性导致的化学多样性和关键酶的作用，丰富了芽孢杆菌中环肽的种类。

已报道的 Turnagainolides 结构多样性主要源于第 4 位氨基酸残基、Hppa 和 Val - 5 的立体化学变化。本研究发现的 4 种新化合物在第 3 位氨基酸残基上出现新变化，体现了生物合成中酶的混杂性和保守性。

以往从多种微生物中鉴定出 Turnagainolides，但细菌和真菌间生物合成基因簇转移罕见。本研究通过多种实验将 Turnagainolides 的产生与tur - BGC 直接关联，为探索其他微生物中 Turnagainolides 的结构多样性和生物合成机制提供了框架。同时，研究发现参与 Turnagainolide 生物合成的酶在芽孢杆菌属中存在同源序列，支持了以往非芽孢杆菌属中发现的 Turnagainolides 可能源于污染或共生芽孢杆菌的假设。

芽孢杆菌属中已报道多种环肽，如表面活性素（surfactin）、杆菌霉素（bacillomycin）、丰原素（fengycin）和伊枯草菌素（iturins）等，它们与 Turnagainolides 结构和生物活性存在差异。Turnagainolides 环肽环较小且无长链脂肪酸，仅表现出对生物膜形成的中度抑制作用，而其他环肽具有较强抗菌和抗真菌活性，推测长链脂肪酸在这些环肽抗菌活性中起重要作用。这些环肽均通过 NRPS 组装线合成，其中 Turnagainolides 的腺苷化（A）结构域存在底物特异性和混杂性，为工程化改造肽结构提供了可能。

微生物在大环化过程中利用硫酯酶等策略克服化学合成中的难题，Turnagainolide 生物合成途径中的 TE 结构域可催化链释放和环化，相比化学环化具有诸多优势，为短肽环化提供了新途径。此外，tur - BGC 中包含的 II 型 PKS 模块在环化前延伸线性肽链，可能有助于减少空间位阻，促进大环化。

Turnagainolides 及其同系物生物活性多样，结构差异与功能特性相关。如 Turnagainolide B 中S - Hppa 构型对激活 SHIP1 酶至关重要，Turnagainolide C 中d - Val - 5 残基使其具有抗菌活性。本研究中化合物 1、2、3 的抗生物膜活性差异以及化合物 4 的抗癌活性，表明 Turnagainolides 可能具有更广泛的生物活性，值得进一步探索。

材料和方法

1. 菌株分离和系统发育分析：从中国西沙 18 米深的珊瑚礁采集海绵样本，经处理后在添加不同抗生素的 30% R2A 培养基平板上分离培养，挑取单菌落纯化，通过菌落 PCR 扩增 16S rRNA 基因并测序，经 BLAST 分析进行分类鉴定。
2. 发酵：枯草芽孢杆菌 LP 种子培养在 100% R2A 液体培养基中，28℃、160 rpm 振荡培养 2 天，然后以 1% 接种量接种到含有 2% 大孔吸附树脂 HP - 20 的 100% R2A 培养基中，大规模发酵 7 天。
3. 化合物分离和纯化：发酵结束后，收获 HP - 20 树脂，用甲醇洗脱，浓缩得到粗提物。粗提物经硅胶柱层析，用不同比例溶剂洗脱得到多个馏分，通过 HPLC 分析。含 Turnagainolides 的馏分进一步经半制备 HPLC 纯化，得到 6 种单体化合物。
4. LC - MS 分析：使用 Waters Xevo G2 - XS 四极杆飞行时间质谱仪，在特定色谱条件和质谱参数下对样品进行分析。
5. NMR 分析：在 Bruker Avance IIIHD 600 MHz 光谱仪上记录 NMR 光谱，化学位移以残留溶剂为参考。
6. Marfey’s 衍生化：将化合物水解后与 1% l - FDLA 反应，衍生化样品经 LC - MS 分析，使用特定色谱柱分离氨基酸。
7. 化合物酯化：化合物与 5% NaOMe/MeOH 反应，经中和、萃取、纯化得到产物。
8. Mosher 衍生化：化合物与（R） - MTPA - Cl 或（S） - MTPA - Cl 在吡啶中反应，产物经半制备反相 HPLC 纯化后用 NMR 光谱分析构型。
9. 生物膜抑制实验：培养金黄色葡萄球菌，调整浓度后加入 96 孔板，添加不同浓度测试化合物，孵育后固定、染色，通过测量 OD???值评估生物膜形成抑制情况。
10. 细胞毒性测试：采用 MTT 比色法评估化合物细胞毒性，细胞接种培养后加入 MTT 溶液，孵育后溶解甲臜晶体，测量 OD???值。
11. 基因组测序和 anti - SMASH 预测：提取枯草芽孢杆菌 LP 基因组 DNA，进行测序和组装，用 anti - SMASH 软件分析基因组序列预测生物合成基因簇。
12. 基因敲除：按照特定方法设计引物，利用 CHOPCHOP 工具设计 sgRNA 序列，通过重叠 PCR、质粒构建和转化等步骤敲除tur7基因，用菌落 PCR 验证突变株，通过 HPLC 分析突变株和野生型菌株发酵提取物。