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本文聚焦于砷污染问题，研究发现芽孢杆菌（Lysinibacillus）sp. OR-15 中的 QueF 和 QueE 蛋白可介导砷生物吸附。砷响应蛋白 ArsR 调节 que 操纵子表达，保守半胱氨酸残基对蛋白结合砷至关重要。该研究为微生物砷解毒机制提供新见解。
一、研究背景
砷是一种广泛存在于环境中的有毒类金属，其污染问题日益严峻。在自然状态下，砷主要以无机形式（如砷酸盐 [As (V)] 和亚砷酸盐 [As (III)]）以及有机砷化合物的形式存在。不同化学形态的砷毒性各异，通常情况下，三价有机砷化合物 > As (III) > As (V) > 五价有机砷化合物 。砷污染的来源包括自然过程（如火山活动、矿物风化）和人为活动（如采矿、燃烧化石燃料、过度使用含砷农药）。砷污染的地下水和土壤对众多国家（如中国、越南、美国、孟加拉三角洲地区）的环境和公共健康构成严重威胁。人类长期暴露于高浓度砷环境中，会增加患癌风险，严重损害肝脏、肾脏等重要器官。
微生物在砷的地球化学循环中发挥着关键作用。经过长期进化，微生物通常将抗砷基因定位在抗砷操纵子（ars 操纵子）中 。在大多数微生物基因组中，ars 操纵子一般包含 As (III) 感应调节因子、As (V) 还原酶和 As (III) 通透酶。ArsR 阻遏蛋白可根据细胞内 As (III) 浓度控制 ars 操纵子的表达。抗砷细菌的主要解毒过程之一是排出多种类型的砷，此外，细菌还可通过 As (III) 氧化酶 AioBA 将 As (III) 氧化为毒性较低的 As (V) 来解毒，这也是微生物修复砷污染的有效途径 。近年来，研究发现多种微生物对砷具有生物吸附能力，但细菌细胞内砷生物积累的机制仍有待深入探究。目前的研究多集中于 ars 操纵子，可能忽略了一些对细菌砷代谢至关重要但不在 ars 操纵子中的基因。
二、研究内容
- Lysinibacillus sp. OR-15 的砷抗性、去除表型及基因分析
研究人员在 R2A 培养基中评估了 Lysinibacillus sp. OR-15 对 As (III) 的耐受性和积累能力。在不同浓度（0.10、0.20 和 0.30 mM）的 As (III) 条件下，菌株 OR-15 能够从培养上清液中特异性地去除一定比例的总砷，且随着砷浓度的增加，去除的总砷量也相应增加 。同时，不同 As (III) 浓度对菌株的生长、滞后期和裂解期无显著影响，但菌株会使培养上清液的 pH 值升高 。经测定，菌株 OR-15 对 As (III) 的最大抑制浓度（MIC）为 5 mM 。
基因分析发现，Lysinibacillus 菌株中的 queF、queC、queD 和 queE 基因聚集在一起。通过设计特异性引物进行 PCR 扩增，结果表明这些基因是共转录的，且位于同一转录本上。当暴露于 0.1 mM As (III) 时，Lysinibacillus sp. OR-15 中 queF、queC、queD 和 queE 基因的表达水平上调，暗示该操纵子可能在砷相关代谢过程中发挥作用 。
2. QueF 和 QueE 增强细菌对 As (III) 的抗性并表现出与 As (III) 的结合亲和力
为研究这四个基因在砷相关代谢过程中的功能，研究人员在砷敏感的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 AW3110 中分别进行了异源过表达实验。结果显示，queF 或 queE 基因的异源过表达增强了 AW3110 菌株对培养上清液中总砷的去除能力，同时提高了菌株对 As (III) 的耐受性 ，而 queC 或 queD 基因的过表达对 As 生物积累的改善作用不明显。
研究人员进一步纯化了 QueF 和 QueE 蛋白，并利用内在色氨酸淬灭和纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）评估它们与 As (III) 的结合能力。结果表明，随着 As (III) 浓度的增加，QueF 和 QueE 蛋白的荧光强度均呈现浓度依赖性淬灭 。计算得出 QueF 与 As (III) 结合的解离常数（Kd）为 5.32 ± 1.453 μM，QueE 与 As (III) 结合的 Kd 为 8.425 ± 1.612 μM 。此外，实验还证明 QueF 和 QueE 蛋白均能结合 As (V)，但对 Sb (III) 无结合亲和力 。
生物信息学分析显示，QueF 和 QueE 蛋白均不含跨膜结构域，属于细胞质蛋白。通过对异源表达这些蛋白的砷敏感菌株进行分级实验，发现表达 QueF 和 QueE 蛋白的菌株培养上清液中砷含量显著降低，细胞内砷含量显著增加，且砷积累主要发生在细胞质中 。
3. QueF 和 QueE 中保守半胱氨酸残基在 As (III) 结合中起关键作用
在 QueF 的同源物中，有三个半胱氨酸残基（Cys50、Cys57 和 Cys101）是保守的。研究人员对这三个残基进行点突变后，在 AW3110 菌株中进行实验。结果发现，Cys101 位点的突变损害了 As 生物积累，并降低了菌株对 As (III) 的抗性 。纯化的 Cys101 突变蛋白与不同浓度的 As (III) 或 As (V) 孵育时，色氨酸荧光强度和 nanoDSF 结果均无显著变化，表明 Cys101 残基对 QueF 与 As (III) 和 As (V) 的结合至关重要 。
在 QueE 的同源物中，保守半胱氨酸残基位于 Cys33、Cys37 和 Cys40 位点。对这些位点进行突变后发现，Cys37 和 Cys40 位点的突变降低了 AW3110 菌株对 As (III) 的生物积累和抗性 。Cys37 突变的 QueE 蛋白与不同浓度的 As (III) 和 As (V) 孵育时，色氨酸荧光强度和 nanoDSF 结果均无明显变化，说明 Cys37 残基在 QueE 与 As (III) 结合中起关键作用 。而 Cys40 突变则影响了 QueE 蛋白的结构稳定性，导致纯化的蛋白沉淀和聚集。
4. ArsR 在 As (III) 条件下调节 que 操纵子的表达
为探究 OR-15 菌株中 que 操纵子如何感知 As (III) 信号，研究人员进行了 lacZ 报告基因分析和电泳迁移率变动分析（EMSA）。EMSA 实验表明，纯化的 ArsR 蛋白能够与 que 操纵子启动子和 arsR 调控序列结合，且随着 As (III) 浓度的增加，这种结合作用逐渐减弱 。lacZ 报告基因分析结果显示，单独的 arsR 启动子或 que 启动子区域的表达与 As (III) 水平无显著相关性，但当 arsR 启动子区域与 ArsR 编码基因共表达，或 queF 启动子区域与 ArsR 编码基因共表达时，在 As (III) 暴露下，报告基因的表达显著增加 。这些结果证实了 ArsR 在 As (III) 存在的条件下调节 que 操纵子启动子的表达。
三、研究结论
本研究揭示了 Lysinibacillus sp. OR-15 中一种新的细菌砷解毒机制。ArsR 能够感知细胞内 As (III) 信号，并与 que 操纵子的上游启动子区域结合。当细胞摄取 As (III) 后，ArsR 与 As (III) 结合并从 que 操纵子启动子区域解离，从而启动 queF 和 queE 基因的表达。产生的 QueF 和 QueE 蛋白能够螯合细胞内游离的 As (III)，降低其生物利用度，进而减少其毒性 。
然而，Lysinibacillus sp. OR-15 的遗传操作系统构建存在较大挑战，开发基因敲除或过表达菌株将有助于更全面地了解砷结合蛋白 QueF 和 QueE 在细菌抗砷中的具体作用。目前，表面展示重金属结合蛋白的工程菌株已被用于污染修复，本研究中鉴定的砷结合蛋白 QueF 和 QueE 有望成为潜在的砷污染修复生物材料。但在实际应用中，需要严格评估蛋白组装和表面展示稳定性对砷吸附效率的影响，同时要解决过表达工程菌株死亡后砷释放的问题 。
