Synchronized temporal-spatial analysis via microscopy and phosphoproteomics (STAMP)：解析细胞静止期的新利器

细胞静止期（G0）的调控机制对维持体内平衡至关重要，但其时空机制尚不明确。为解决这一问题，研究人员开展了 STAMP（同步时空分析，结合显微镜和磷酸化蛋白质组学）相关研究。结果揭示了G0转换和纤毛发生过程中的变化，为研究细胞信号传导提供新方法，助力靶向治疗。

　　在细胞的世界里，细胞周期的调控如同精密的时钟，有条不紊地维持着身体的稳态。其中，大多数细胞处于静止期（G0），这一状态对于组织的正常功能至关重要。然而，目前许多病理情况，如癌症、神经衰老和慢性代谢疾病等，都与组织特异性G0的破坏有关。但由于缺乏有效的研究手段，人们对建立G0的时空机制及其信号枢纽 —— 初级纤毛的了解十分有限。以往的研究多依赖癌细胞系，难以深入探究健康静止细胞的信号传导情况。此外，传统方法在诱导纤毛发生时，细胞进入G0和纤毛发生的不同步，使得难以捕捉到短暂的细胞和分子变化。为了填补这些知识空白，深入了解细胞静止期的调控机制，研究人员开展了一系列研究。
研究人员开发了同步时空分析（STAMP，synchronized temporal-spatial analysis via microscopy and phosphoproteomics）技术，将显微镜技术与磷酸化蛋白质组学相结合，用于追踪细胞在G0转换和纤毛发生过程中的变化。该研究主要使用人端粒酶逆转录酶永生化的人视网膜色素上皮细胞（hTERT-RPE-1）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为模型系统。研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为细胞生物学研究和人类健康领域开辟了新的道路。
研究人员为开展这项研究，主要运用了以下几种关键技术方法：一是细胞同步化技术，通过多步处理使细胞同步进入G0期，提高细胞同步性；二是免疫荧光（IF）技术，用于标记和观察细胞内特定蛋白的定位和变化；三是磷酸化蛋白质组学技术，检测细胞在不同时间点的磷酸化修饰情况；四是活细胞成像技术，实时观察细胞动态变化过程。
研究结果主要通过以下几方面呈现：

• 前提：研究人员开发了细胞同步化方案，获得了纯的中期细胞群体，并跟踪G0进展过程中的时间依赖性事件。结合固定细胞和活细胞成像与先进的磷酸化蛋白质组学，观察到细胞事件与其相关的磷酸化状态之间存在强相关性，提出了关于特定蛋白质及其磷酸化在调节功能和定位中作用的可测试假设。
• 同步细胞的生成：研究人员开发了一种严格的策略来同步细胞向静止期的转变，以纤毛发生作为G0进展的关键标记。通过优化多种条件，建立了一个多步同步化方案，实现了细胞在有丝分裂和纤毛形成过程中的高度同步化。
• 蛋白质定位的时间变化揭示静止期转变阶段：通过固定细胞进行 IF 检测，研究人员构建了G0进入和纤毛发生步骤的时间图谱。确定了包括细胞分裂完成、各种蛋白质向基体招募、过渡区形成、纤毛组装和G蛋白偶联受体（GPCR）进入纤毛等关键事件的时间节点，同时发现不同细胞内组件在这一过程中的动态变化。此外，在 MEFs 中重复研究，验证了该同步化策略的普适性。
• 磷酸化蛋白质组学揭示从有丝分裂到G0进入不同时间点的瞬时磷酸化：利用磷酸化蛋白质组学监测细胞在不同时间点的磷酸化情况，发现了如 TTBK2 [S786] 等关键磷酸化位点。TTBK2 [S786] 在纤毛发生后期丰度升高，对驱动后期纤毛发生至关重要。此外，还鉴定了许多其他蛋白质的磷酸化事件，通过相关性分析生成了关于G0转换过程中细胞程序动态变化的假设。
• STAMP 揭示的 NPC 机制和自噬机制的调节：研究人员追踪已知有丝分裂调节因子的磷酸化，发现其时间标记的磷酸化特征与已知功能相符。同时，在自噬相关通路中也观察到关键的分级信号传导，如 GSK - 3β 在不同阶段的磷酸化变化，暗示自噬在G0转换过程中的动态调节。通过 IF 观察溶酶体分布，进一步证实了自噬与G0进展的关联。
• 通过活细胞成像定义驱动纤毛发生的详细时间标记事件：利用活细胞成像技术，研究人员观察到细胞在进入静止期过程中的多种动态变化，如细胞分裂后微管蛋白和 IFT88 的聚集形成 “桶状” 结构、中心体的动态定位、纤毛发生过程中各个阶段的时间节点以及对 Sonic Hedgehog（SHH）信号通路刺激的响应等。
• 应用 PIT - STAMP 剖析时空机制：研究人员开发了脉冲抑制剂处理（PIT） - STAMP 方法，通过在不同时间处理同步化的 RPE 细胞，测试特定调节因子对G0程序的影响。发现蛋白质合成早期对纤毛发生至关重要，细胞质动力蛋白在轴突延伸和货物运输中起关键作用。
• 使用基因修饰辅助特定过程的排序和剖析：通过对 ARL13B、TTBK2 和 IFT52 基因敲除（KO）细胞系的研究，发现不同 KO 细胞系在纤毛发生缺陷方面存在差异，揭示了这些蛋白质在纤毛发生过程中的不同作用机制。
• 使用 STAMP 识别G0中细胞功能的关键调节因子：基于磷酸化蛋白质组学和时间标记的相关聚类，研究人员发现了 PRKD1 和 SV2A 等关键纤毛发生调节因子。抑制 PRKD1 和 SV2A 的功能会影响纤毛发生，表明它们在纤毛发生过程中具有重要作用。
  研究结论和讨论部分指出，STAMP 技术为研究细胞内蛋白质翻译后修饰（PTMs）、定位和功能的时空变化提供了一种强大的工具。通过该技术，研究人员深入了解了G0程序和纤毛功能的详细瞬时信号机制，这些机制的破坏与多种疾病相关。STAMP 技术有助于确定疾病中G0被破坏的机制，为研究纤毛病中纤毛组装和功能缺陷提供了新视角，为精准治疗开发奠定了基础。尽管该研究存在一些局限性，如化学抑制剂可能引入实验误差、时间分辨率有限等，但 STAMP 技术仍具有广阔的应用前景。它可以与其他技术如磷酸化位点特异性诱变、RNA 测序等结合，进一步深入研究细胞调节机制，为生命科学和医学领域带来新的突破。