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TDP-43 蛋白磷酸化对其功能及神经退行性疾病进展影响重大，但位点特异性磷酸化研究受限。研究人员半合成全长 TDP-43（TDP1-414[pS48]），发现其自缔合特性改变。这为理解 TDP-43 修饰致病机制提供关键依据。
在神经科学的神秘领域中，有一种名为 TDP-43（Transactive response DNA-binding protein 43 kDa）的蛋白，它如同一个神秘的 “双面间谍”，在细胞核与细胞质之间穿梭，扮演着截然不同的角色。TDP-43 由 414 个氨基酸残基组成，包含 N - 末端结构域（NTD）、两个 RNA 识别基序（RRM1 和 RRM2）以及 C - 末端低复杂性结构域（LCD）。在细胞核中，它通过自缔合参与 RNA 代谢，对正常的生理基因调控至关重要；然而，当它异常地聚集在细胞质中，形成由错误 β- 折叠构成的淀粉样物质时，却会引发如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等严重的神经退行性疾病。
蛋白质的翻译后修饰是调节其功能的重要机制，TDP-43 的磷酸化就是其中之一。磷酸化能够改变 TDP-43 的自缔合特性，进而影响它在细胞核中的正常生理功能以及在细胞质中的淀粉样聚集潜力，最终对疾病进展产生深远影响。但由于获取位点特异性磷酸化的 TDP-43 困难重重，人们对每个残基磷酸化在自缔合过程中所起的作用了解极为有限。就像在黑暗中摸索，虽然知道前方有重要的线索，但却难以找到那关键的 “开关”。
为了揭开这层神秘的面纱，来自和歌山医科大学（Wakayama Medical University）的研究人员挺身而出，踏上了探索之旅。他们开展了一项极具创新性的研究，成功半合成了在第 48 位丝氨酸残基上均匀磷酸化的全长 TDP-43（命名为 TDP1-414[pS48]）。这一成果意义非凡，它就像一把精准的 “钥匙”，为深入了解 TDP-43 翻译后修饰与神经退行性疾病之间的关系打开了新的大门。
研究人员在开展此项研究时，运用了多个关键技术方法。首先是天然化学连接（native chemical ligation）技术，它能将不同的肽段连接成完整的蛋白质；其次是 His 标签亲和层析（His-tag affinity chromatography）技术，利用该技术可高效分离目标蛋白。此外，还借助了透射电子显微镜（TEM）观察蛋白的聚集形态，以及小角 X 射线散射耦合尺寸排阻色谱（SEC-SAXS）分析蛋白的三维结构 。
下面来看看具体的研究结果：
- 全长 TDP-43 的半合成：研究人员计划通过天然化学连接反应，将含有 N 端半胱氨酸（Cys）的 TDP50-414与 TDP1-49- 硫酯连接起来合成 TDP1-414[pS48]。在重组合成 TDP50-414时，他们使用了几丁质结合域（CBD）亲和层析与 pH 依赖的自切割内含肽元件相结合的蛋白质纯化系统。尽管分离足够量的 CTD 通常因高聚集倾向而困难，但他们成功高效获得了 TDP50-414。随后，通过天然化学连接和 His 标签亲和层析，成功得到了高纯度的 TDP1-414[pS48]，同时也合成了非磷酸化的 TDP1-414作为对照。
- 全长 TDP-43 的自缔合特性：研究人员对 TDP1-414[pS48] 和非磷酸化 TDP1-414的自缔合特性进行研究。沉降实验表明，在 37°C 孵育 6 - 48 小时时，TDP1-414[pS48] 上清液中的蛋白质含量显著高于非磷酸化 TDP1-414，说明其自缔合倾向更低。透射电子显微镜（TEM）分析显示，非磷酸化 TDP1-414孵育 24 小时后可观察到典型的淀粉样原纤维和各种大小的寡聚体，而 TDP1-414[pS48] 则未观察到典型淀粉样原纤维，而是出现许多直径超过 100nm 的大聚集体 。
- N 端 TDP1-80的研究：由于 NTD 之间的分子间相互作用对 TDP-43 在细胞核中的生理自组装很重要，研究人员合成了 TDP1-80[pS48] 和非磷酸化 TDP1-80。尺寸排阻色谱（SEC）和交联实验表明，TDP1-80[pS48] 的自缔合倾向低于非磷酸化 TDP1-80。通过 SEC-SAXS 分析，研究人员成功解析了 TDP1-80[pS48] 的三维结构，发现其与非磷酸化 TDP1-80在包含丝氨酸 48 的 β- 链 - 环 - β- 链区域存在显著结构差异。在非磷酸化 TDP1-80的二聚体单元中，丝氨酸 48 的侧链羟基与谷氨酸 17 的侧链羧酸盐形成氢键，而磷酸化后，丝氨酸 48 的侧链位于无法与谷氨酸 17 形成氢键的位置，这种静电排斥可能导致 TDP1-80[pS48] 自缔合特性降低。
综合上述研究，研究人员得出结论：成功半合成了在丝氨酸 48 位磷酸化的全长 TDP-43（TDP1-414[pS48]），且发现其与非磷酸化 TDP-43 相比，自缔合特性较弱，形成的聚集体也不是典型的淀粉样原纤维。对 NTD 片段（TDP1-80）的研究表明，丝氨酸 48 侧链的磷酸根离子通过诱导静电排斥减弱了 NTD 之间的相互作用。这一研究成果为理解 TDP-43 翻译后修饰在神经退行性疾病中的病理机制提供了重要依据，让我们在探索神经退行性疾病病因的道路上又前进了一大步，有望为未来开发针对性的治疗策略奠定基础，为众多受神经退行性疾病困扰的患者带来新的希望。
