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为探究山金车（Arnica montana L.）对诱导子反应的分子机制，研究人员开展了内参基因筛选研究。利用四种算法评估 9 个候选基因，发现 ATP - 合酶和 ACT 是最佳内参基因。该成果为研究药用植物次生代谢调控提供了关键依据。
在植物的奇妙世界里，山金车（Arnica montana L.）这种珍贵的药用植物宛如一颗璀璨的明珠。它属于菊科，在欧洲传统医学中已有数百年的应用历史，蕴含着丰富的生物活性化合物，像倍半萜内酯、黄酮类、脂肪酸、百里酚衍生物以及绿原酸等。这些化合物赋予了山金车抗炎、抗癌、抗氧化、抗菌、抗血小板和免疫调节等诸多神奇功效。
然而，由于过度采集用于草药用途、适宜栖息地的丧失以及气候变化等因素，山金车如今已成为珍稀濒危物种。同时，其生物活性化合物的天然产量极低，还容易受到疾病、环境和气候波动的负面影响，使得大规模从天然来源生产这些化合物困难重重。因此，探寻提高山金车生物活性化合物产量的有效方法迫在眉睫。
植物生物技术中的诱导子技术为解决这一难题带来了希望。诱导子（如甲基茉莉酸（MeJA）、水杨酸（SA）和酵母提取物（YE））能够通过引发氧化应激，激活植物细胞的免疫系统，改变代谢和生化途径，进而提高次生代谢物的合成与积累。要深入了解山金车对诱导子的反应机制，研究基因表达变化至关重要，而这离不开稳定的内参基因（RGs）进行数据标准化。但常用内参基因在不同物种、条件下表达并不稳定，所以确定山金车在诱导子处理下稳定表达的内参基因就显得尤为关键。
来自波兰卢布林生命科学大学植物遗传学、育种和生物技术研究所，以及保加利亚科学院植物生理学和遗传学研究所的研究人员，针对这一问题展开了深入研究。他们通过一系列实验，最终确定了 ATP - 合酶与 ACT 是山金车在诱导子处理下进行 RT - qPCR 数据标准化的最佳内源性对照。这一发现为深入研究山金车次生代谢调控的分子过程提供了有力支持，有助于推动药用植物生物技术领域的发展，为保护和利用山金车这一珍稀药用植物资源开辟新的道路。该研究成果发表在《BMC Plant Biology》上。
研究人员在研究过程中主要运用了以下关键技术方法：首先，对山金车种子进行消毒处理，诱导芽培养并获取外植体进行诱导子处理实验；接着，采用 TRIzol 试剂提取 RNA，利用 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT - qPCR 进行逆转录合成 cDNA；然后，基于文献和前期研究筛选 9 个候选内参基因，设计引物进行 RT - qPCR 反应；最后，运用 geNorm、NormFinder、BestKeeper 和 ΔCt 方法分析候选内参基因的表达稳定性。
研究结果
- 引物效率和特异性：研究中使用的引物对特异性良好，熔解曲线显示均为单峰，扩增效率在 98%（TUBb）到 105%（F - box）之间，回归系数均≥0.996。
- 候选内参基因的表达稳定性
- geNorm 算法：计算出平均表达稳定性值（M），M 值与表达稳定性呈反比。结果显示所有测试基因的 M 值均低于 1.5，最稳定的内参基因对是 ATP - 合酶和 F1 - ATPase，ACT、F - box 等 5 个基因表达稳定性相似，TUBb 表达变异性最高。通过成对变异分析表明，两个表现最佳的内参基因足以对实验条件下的 RT - qPCR 数据进行适当标准化。
- NormFinder 算法：该算法对每个基因单独评估，根据稳定性值（SV）对候选基因进行排序，SV 越低越稳定。SKIP16 被认为是最稳定的内参基因，F - box、GAPDH 和 ATP - 合酶也表现出良好的表达稳定性，TUBb 仍是最不稳定的候选基因。
- BestKeeper 算法：基于 Cq 值的标准差对候选基因稳定性进行排序，实验中最稳定的内参基因对是 ACT 和 ATP - 合酶，F - box 也表现出较高的表达稳定性。
- ΔCt 方法：该方法表明 ATP - 合酶、F1 - ATPase 和 F - box 表达最稳定。综合四种算法结果，ATP - 合酶和 ACT 是诱导条件下表达最稳定的基因对，PP2A 和 TUBb 表现较差。
- 内参基因的验证：研究人员以 PAL、4CL 和 HQT 为目标基因，分别用两个表现最佳（ATP - 合酶和 ACT）和两个表现最差（PP2A 和 TUBb）的内参基因进行数据标准化。结果发现，使用合适的内参基因时，MeJA 处理能显著上调 PAL 和 HQT 基因的表达；而使用不稳定的内参基因时，部分基因表达变化的显著性受到影响，4CL 基因对诱导子处理无响应。
研究结论与讨论
本研究通过对山金车在诱导子处理下 9 个候选内参基因表达稳定性的研究，明确了 ATP - 合酶与 ACT 是最佳内源性对照，PP2A 和 TUBb 不适合作为诱导研究中的内参基因。这一结论为后续研究山金车及其他药用植物次生代谢调控的分子机制奠定了重要基础，有助于更准确地分析基因表达变化，为提高药用植物生物活性化合物产量提供理论依据，在药用植物生物技术领域具有重要的应用价值。同时，研究结果也表明不同算法对候选内参基因的评估存在差异，但在确定最不稳定的内参基因方面具有一致性，这为内参基因筛选方法的选择提供了参考。
