综述：CRISPR/Cas9 技术在水稻耐热性研究中的应用

本文聚焦水稻耐热性，综述 CRISPR/Cas9 系统的应用。该技术可敲除相关基因，研究其在钙信号传导、激素调节等途径的作用机制，为培育耐热水稻品种提供理论依据，对保障粮食安全意义重大。

　　

引言

水稻（Oryza sativa L.）是全球重要的粮食作物，为超半数人口提供主食。然而，全球气温上升引发的热胁迫，严重制约水稻生产。高温破坏水稻的生理进程，如导致膜损伤、光合作用改变、碳水化合物代谢紊乱和植物激素失衡 。在灌浆期，高温会降低稻米品质，减少粒重、增加垩白度 。培育耐热水稻品种对保障未来粮食安全至关重要。

传统育种、突变育种、转基因育种和基因组编辑等方法都被用于提高水稻的耐热性。但转基因作物因存在健康和环境安全争议，在许多国家的应用受限。相比之下，基因编辑技术受法规限制较少。CRISPR/Cas9 系统作为基因编辑工具，在研究基因功能和培育多抗作物品种方面潜力巨大，已广泛应用于水稻研究。

植物耐热性的机制

植物在热胁迫下，通过多种独立或相互关联的代谢、信号传导和调节途径来抵御热害。热胁迫诱导转录因子（TF）、信号分子、应激响应基因、激素和次生代谢物的合成，从而激活耐热反应。

高温促使活性氧（ROS）积累，ROS 会损伤蛋白质、脂质、多糖、色素和 DNA，引发氧化损伤。但 ROS 的过量产生也能作为信号分子，激活热响应基因。钙、环核苷酸、钙依赖蛋白激酶（CDPKs）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、G 蛋白和植物激素等信号分子，与转录因子及其他调节分子协同作用，在热响应基因激活中发挥重要作用。植物激素可调节氧化应激，控制热相关基因的表达，协调不同信号转导途径，提高植物耐热性。

热胁迫响应基因激活后，抗氧化剂会清除过量的 ROS，维持氧化还原稳态。抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）或谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等抗氧化酶活性的提高，有助于保护植物免受氧化损伤，增强植物耐热性。糖、脯氨酸和甜菜碱等渗透调节物质的积累，在植物应对热胁迫中也至关重要。热激转录因子（HSFs）调控的热激蛋白（HSPs），作为分子伴侣，能提高膜稳定性、维持蛋白质正确折叠、抑制蛋白质变性，对植物在热胁迫下的存活至关重要。脱水响应元件结合蛋白（DREB）、髓细胞白血病蛋白（MYB）、碱性亮氨酸拉链蛋白（bZIP）、WRKY 和 NAC（NAM、ATAF1/3 和 CUC1/2）等转录因子家族，参与调节热响应基因的表达。

CRISPR/Cas9 系统

CRISPR/Cas9 是一种 RNA 引导的核酸酶系统，可在细胞中实现位点特异性基因组编辑，通过引入双链 DNA（dsDNA）断裂来实现。细菌的 CRISPR 最早在大肠杆菌基因组中被发现，随后在多种细菌中检测到。该系统中的 Cas9 核酸酶，与两种非编码 RNA（CRISPR RNA（crRNA）和反式激活 CRISPR RNA（tracrRNA））结合形成复合物，tracrRNA 与 crRNA 部分互补。在实验室中，crRNA 和 tracrRNA 可融合为单链引导 RNA（sgRNA），引导化脓链球菌 Cas9 进行 DNA 切割。

Cas9-sgRNA 复合物识别与 sgRNA 中 20 个核苷酸（nt）序列匹配的靶 DNA，前提是存在原间隔相邻基序（PAM）。PAM 序列因细菌来源不同而不同，如化脓链球菌 Cas9 识别 5′ NGG - 3′ 的 PAM 序列（N 代表任意核苷酸），PAM 相邻的 10 - 12 nt 序列（种子序列）决定靶向特异性。种子序列出现错配会阻碍靶 DNA 结合，使 CRISPR 介导的切割无法进行。Cas9 蛋白含有 HNH 和 RuvC 核酸酶结构域，可切割 DNA 双链，在 PAM 上游 3 nt 处产生平端双链断裂（DSB）。DSB 可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行修复。NHEJ 有时会导致小的插入或缺失（indels），引起移码突变，破坏基因功能；HDR 则可通过引入外源供体 DNA 填补缺口。利用 CRISPR/Cas9 对目标基因特定位点进行敲除突变，可研究基因功能，还能进行多重基因编辑，敲除多个基因，探究基因群的功能。

此外，为拓展该系统的应用，还开发了碱基编辑、引导编辑、表观基因组编辑、CRISPR 激活或干扰等先进技术，同时也利用 Cas12a、Cas13、Cas14 等替代 Cas 蛋白，以及 xCas9 和 SpCas9-NG 等 Cas9 变体酶，提升基因编辑效果。

CRISPR 探究耐热性的遗传基础

CRISPR 系统通过敲除耐热和感热基因，研究植物中的胁迫相关基因，以下是其在水稻耐热性研究中的部分应用：

• 胁迫信号与耐热性：钙信号参与调节植物对多种非生物胁迫的响应。研究发现，水稻中两个紧密相关的环核苷酸门控离子通道（CNGC）蛋白 OsCNCG14 和 OsCNGC16，在高温胁迫下，其功能缺失突变体的存活率低于野生型，H₂O₂含量更高、细胞死亡更多，且钙信号存在缺陷，表明它们正向调节水稻耐热性。

多种富含亮氨酸重复序列的类受体激酶（LRRRLKs）参与感知外部信号、触发保护机制和调节植物对非生物胁迫的响应。研究发现，热敏核雄性不育 10（TMS10）及其同源基因 TMS10-like（TMS10L）与水稻花药绒毡层发育和雄性育性温度响应相关；富含亮氨酸重复受体激酶（LRK1）参与调节水稻叶片暗呼吸，LRK1 突变体暗呼吸降低，形态生长受阻。

• 热激因子与耐热性：热激蛋白（HSP）是植物热激反应的关键组成部分，HSP60 对叶绿体功能至关重要。研究表明，水稻中 HSP60 - 3b 基因参与调节高温下花粉淀粉颗粒形成，对水稻花粉在生殖发育阶段的耐热性至关重要。

热耐受基因 3（HTG3）编码的热激因子正向调控水稻耐热性，敲除 HTG3 的突变体在生殖阶段对热胁迫更敏感，结实率降低。热胁迫诱导的转录因子 SPOTTEDLEAF7（OsSPL7）可调节下游基因表达，维持 ROS 平衡，其下游靶基因 β - 半乳糖苷酶 9（OsBGAL9）敲除突变体表现出矮化、生长迟缓、高温下存活率低等表型。

• 植物激素与耐热性：水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、赤霉素（GA）和乙烯（ET）等植物激素，参与介导植物对热胁迫的耐受性。ABA 在调节植物生长、代谢和胁迫响应中起重要作用，9 - 顺式 - 环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED1）可调节 ABA 积累，敲除 OsNCED1 的突变体对高温更敏感，表明该基因通过增加 ABA 含量，提高抗氧化活性、激活热和 ABA 响应基因表达、减少膜损伤和 ROS 积累，正向调控水稻耐热性。

ABA 受体基因 OsPYL1、OsPYL4 和 OsPYL6 功能缺失的水稻突变体，在田间表现出更好的生长和产量，对热胁迫耐受性更强。激素响应基因 OsGER4 编码的胚芽蛋白样蛋白，参与水稻冠根发育，敲除该基因的突变体在热胁迫下冠根数量减少，可能与 ABA 和生长素信号调节的生长素运输有关。生长素吲哚 - 3 - 乙酸基因 OsIAA29 参与调节水稻高温下的灌浆过程，突变体在高温下种子皱缩、垩白度增加、粒重降低。

tRNA^His鸟苷酰转移酶编码基因 Adaptation to Environmental Temperature I（AET），参与 tRNA 修饰，敲除突变体对高温更敏感，表明 tRNA 修饰在调节生长素信号转导和植物高温响应中起关键作用。

• 脯氨酸合成与耐热性：脯氨酸在植物应对多种环境胁迫中起作用，但脯氨酸合成相关基因在热胁迫响应中的作用机制尚不明确。研究发现，敲除编码脯氨酸脱氢酶的水稻基因 OsProDH，可增加脯氨酸含量，提高水稻对热胁迫的耐受性，表明 OsProDH 作为负调控因子，通过调节脯氨酸分解代谢影响水稻耐热性。

• 转录因子与耐热性：转录因子（TFs）通过与顺式作用元件结合，调节靶基因表达，在调控植物复杂胁迫耐受性中起关键作用。研究表明，NAC 结构域转录因子 ONAC127 和 ONAC129 参与调节水稻高温下的种子发育；OsNAC006 基因敲除突变体对热和干旱更敏感，该基因可能通过增强抗氧化酶表达，抵抗高温氧化损伤；质膜相关的 NAC 转录因子 OsNTL3 参与水稻耐热性调节，突变体对热胁迫更敏感，该基因在热胁迫下介导温度信号在质膜、内质网和细胞核间的传递，调节热胁迫响应基因表达。

• 植物结构与耐热性：植物可通过改变自身结构适应逆境，叶片形态与植物结构和胁迫响应相关。研究发现，半卷叶 10（SRL10）基因编码的双链 RNA 结合蛋白，影响水稻叶片形态和耐热性，突变体叶片半卷，对热胁迫更敏感，SRL10 通过稳定过氧化氢酶同工酶 B（CATB），提高其清除 H₂O₂的能力，正向调控水稻耐热性。

敲除高温耐受粳稻品种中的 GS3 基因，可降低植株高度、增加粒长，且不影响碾米品质和蛋白质、直链淀粉含量，突变体在热胁迫后存活率提高，表明 GS3 基因突变可通过调节 Gγ 蛋白，改善粒形、增强耐热性和耐碱性。

• 维持叶绿体功能与耐热性：叶绿体正常功能对植物生长、发育和产量至关重要，高温下叶绿体可感知胁迫并激活相关基因和蛋白，提高植物耐热性。研究表明，RNA 5 - 甲基胞嘧啶（m⁵C）甲基转移酶基因 OsNSUN2，对维持叶绿体功能和提高热胁迫响应至关重要，敲除突变体对高温更敏感，光合作用相关蛋白积累减少、ROS 产生增加；淡绿叶 10（PGL10）基因敲除突变体在高温下叶绿体降解、叶绿素合成减少、光合作用受损，表明该基因在维持水稻光合作用和耐热性中起重要作用；热敏感白化 1（OsHSA1）基因编码的果糖激酶样蛋白 2（OsFLN2），对水稻叶绿体发育和保护至关重要，突变体对热更敏感。

结论与展望

自 2013 年 CRISPR 介导的基因编辑技术首次应用于水稻以来，已取得诸多成果。CRISPR/Cas12a、碱基编辑、引导编辑等技术相继应用于水稻研究。但目前这些先进技术在提高水稻耐热性方面的应用较少，仍有很大研究空间。

CRISPR/Cas9 应用中，脱靶突变是主要问题之一。通过精心设计 sgRNA、改造 Cas9 蛋白提高 PAM 特异性、使用热激诱导的 CRISPR 系统等方法，可降低脱靶风险。热激诱导的 CRISPR 系统已在水稻中成功应用，可产生可遗传突变。

基因编辑技术还可用于将驯化相关性状引入野生稻，实现野生稻的从头驯化。结合 “快速育种” 技术，可加速培育适应气候变化的水稻品种。此外，小 RNA（miRNA）参与植物高温胁迫响应，虽其作用机制尚未完全明确，但已有研究表明敲除水稻 OsmiR535 基因可提高幼苗对干旱和盐胁迫的耐受性。

总之，热胁迫严重影响水稻产量和品质，培育耐热水稻品种对保障全球粮食安全意义重大。CRISPR 技术在揭示水稻耐热相关基因和转录因子功能方面潜力巨大，为基础研究和植物育种开辟了新途径，有望推动耐热水稻品种的培育。