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共焦拉曼光谱（CRS）在测量分层生物组织时存在探测深度受限和物镜易触样本等问题。研究人员开展反向共焦偏振拉曼光谱（RCPRS）用于组织分析的研究。结果显示 RCPRS 能克服上述问题，提升探测深度和灵敏度，为组织分析提供新方法。
在生命科学研究和医学诊断领域，组织分析对于了解生物体的健康状况、疾病的发生发展机制至关重要。共焦拉曼光谱（CRS）技术曾是测量分层生物组织的得力助手，它能获取组织各层的拉曼特征，就像给组织的每一层做 “化学指纹” 鉴定，帮助科学家和医生识别不同组织成分。然而，CRS 技术逐渐暴露出两大难题。其一，它的探测深度有限，在生物组织这个 “深度世界” 里，它难以触及较深的区域，就像一个只能在浅水区活动的探索者；其二，在探测较深的亚表面层时，用于聚焦的物镜常常会触碰到样本表面，如果样本具有酸性或反应性，物镜就可能 “受伤”，这极大地限制了它在实际中的应用。
为了解决这些棘手的问题，来自印度拉贾?拉曼纳先进技术中心（Raja Ramanna Centre for Advanced Technology）的研究人员 Khan Mohammad Khan、Amrita Srivastava 等人开展了一项重要研究。他们另辟蹊径，提出了反向共焦偏振拉曼光谱（RCPRS）技术，并将研究成果发表在《Lasers in Medical Science》上。
这项研究意义非凡。RCPRS 技术成功克服了 CRS 面临的难题，为组织分析带来了新的曙光。它使得在相同的光学系统下能够实现更深的探测，避免了物镜与样本接触的风险，这意味着研究人员可以更安全、更深入地探索组织的奥秘，无论是在基础科学研究中对生物组织的深入剖析，还是在临床医学中对病变组织的精准诊断，RCPRS 都可能发挥关键作用，为生命科学和健康医学领域的发展注入新的活力 。
研究人员在开展研究时，用到了以下几个主要关键技术方法：
首先是搭建 RCPRS 实验系统，使用 785nm 单模二极管激光器，通过一系列光学元件，如消色差双合透镜（ADL）、激光净化滤波器（LCF）等，实现对激光的准直、净化和偏振处理，从而获得符合实验要求的光束。其次，在实验中使用了非生物模型和生物组织样本，非生物模型由不同厚度聚苯乙烯层和特氟龙基底组成，生物组织样本选用鸡胫骨，利用这些样本进行深度敏感拉曼测量实验。最后，对测量得到的拉曼光谱数据进行处理，包括去除暗噪声、荧光背景扣除、归一化等操作，以便获取有效的实验数据。
下面来看看具体的研究结果：
非生物模型测量结果
研究人员使用制备的非生物模型进行实验。从不同轴向偏移下测量的拉曼光谱可知，当照明光束焦点从模型表面向上移动（即轴向偏移增加）时，特氟龙（位于亚表面层）的拉曼峰（如 725cm?1和 1375cm?1 ）强度增加，而聚苯乙烯（表面层）的拉曼峰（995cm?1 ）强度降低。进一步对比 RCPRS 和离焦 SORS（spatially-offset Raman spectroscopy）技术，以特氟龙 1375cm?1 拉曼峰强度与聚苯乙烯 995cm?1 拉曼峰强度的比值（I1375/I995 ）为指标，发现 RCPRS 中该比值随轴向偏移增加的速率比离焦 SORS 更快。而且，研究人员还发现表面层厚度会影响 RCPRS 技术的性能，随着表面层厚度增加，I1375/I995 比值增加的速率也在提高 。
生物组织测量结果
研究人员使用鸡胫骨（肌肉层厚度约 500μm，内部嵌入骨头）作为生物组织样本进行实验。测量不同轴向偏移下的 RCPRS 光谱，发现随着轴向偏移增加，对应骨头（亚表面层）的 958cm?1 拉曼峰强度上升，而对应肌肉（顶层）的 1304cm?1 、1443cm?1 和 1660cm?1 等拉曼峰强度下降。这表明 RCPRS 技术能够有效探测生物组织的亚表面深度。
在研究结论和讨论部分，RCPRS 技术展现出诸多优势。它成功解决了 CRS 技术面临的物镜与样本接触和探测深度受限的问题。与 CRS 不同，RCPRS 通过在样品表面上方聚焦照明光束，并借助偏振器 - 分析仪组件实现深度敏感测量。而且，RCPRS 在更高轴向偏移下仍能测量拉曼信号，探测深度比 CRS 更深。同时，与离焦 SORS 相比，RCPRS 对亚表面层的探测灵敏度更高，且灵敏度提升速率与轴向偏移和表面层厚度相关。不过，RCPRS 技术也存在一些不足，例如部分拉曼峰对偏振敏感，可能影响测量结果；该技术在测量时存在光损失，且缺乏像 CRS 那样的 3 - D 选择性。尽管如此，RCPRS 技术为组织分析提供了一种新的有效方法，未来研究人员计划开发带有手持探头的 RCPRS 系统，并在人体组织上进行测试，进一步探索其应用潜力。这项研究为生命科学和健康医学领域在组织分析方面开辟了新的道路，有望推动相关领域的进一步发展 。
