揭秘 E2 结合酶中氧负离子洞：UFC1 揭示其多因素与可塑性本质

在蛋白质泛素化研究中，E2 酶氧负离子中间体稳定机制不明。研究人员以 UFC1 为对象，发现其利用两种氧负离子洞稳定中间体，受多种因素影响且具适应性。该成果为理解 E2 酶作用机制提供关键线索。

　　在细胞的生命活动中，蛋白质的修饰如同精密仪器中的微调旋钮，对各种生理过程起着至关重要的调控作用。其中，泛素（Ub）或泛素样蛋白（UBL）与靶蛋白的结合，参与了细胞增殖、存活和程序性死亡等诸多关键进程。这一过程依赖于一个复杂的酶级联反应，而 E2 结合酶在其中扮演着关键角色。当 E2 酶与 Ub/UBL 形成带电的复合物（E2~Ub/UBL）后，靶蛋白上的赖氨酸会对其发起亲核攻击，形成一个氧负离子中间体。这个中间体的稳定与否，直接关系到后续反应能否顺利进行，就像接力赛中的关键交接棒环节，稳定的中间体是传递成功的保障。

然而，长期以来，E2 酶中氧负离子的稳定机制一直是科学界的未解之谜。此前有研究指出，E2 酶保守 HPN 基序中的天冬酰胺残基可能通过与氧负离子形成氢键来稳定中间体，但后续的研究对此提出了质疑，这使得该机制更加扑朔迷离。为了揭开这层面纱，来自以色列希伯来大学 - 哈达萨医学院生物化学与分子生物学系等机构的研究人员，以 E2 酶 UFC1 为研究对象，展开了深入探究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解这一复杂的生物学过程带来了新的曙光。

研究人员主要运用了晶体结构解析和体外活性测定等关键技术。在晶体结构解析方面，他们成功解析了多种 UFC1 突变体的晶体结构，包括模拟氧负离子中间体的突变体，这些高分辨率的结构为研究提供了直观的分子层面信息。体外活性测定则通过多种实验，如体外 UFM1 化（ufmylation）实验、核糖体 UFM1 化实验等，精确检测 UFC1 突变体的活性变化，从而深入探究其功能机制。

研究结果

1. UFC1 T106 - K108 氢键对 UFM1 化至关重要：UFC1 的 T106I 突变与婴儿脑病伴进行性小头畸形相关，研究人员解析了 T106I、T106V、T106A 等突变体的晶体结构，并进行体外 UFM1 化实验。结果显示，T106I 和 T106V 突变显著损害 UFM1 化活性，T106A 突变虽也影响活性，但程度较轻。同时，T106 与 K108 形成的氢键对 UFC1 功能至关重要，T106S 突变因保留该氢键，UFM1 化活性与野生型相当，而 T106C 突变因难以形成该氢键，UFM1 化活性大幅降低。
2. T106 - K108 氢键限制 K108 C^α运动：通过对 K108 C^α的 B 因子分析发现，野生型 UFC1 和 T106S 突变体中，K108 C^α的 B 因子较低，运动受限；而在 T106V/L/C 等缺乏 T106 与 K108 氢键的突变体中，K108 C^α的 B 因子显著升高，运动更自由。这表明 T106 与 K108 的氢键限制了 K108 C^α的运动。
3. 稳定氧负离子涉及 K108 C^α氢键：研究人员通过结构模拟和晶体结构解析发现，K108 的 C^α与 UFM1 羰基之间的距离和角度符合氢键形成条件，且 M109 的酰胺也参与氧负离子的稳定。T106I 突变会破坏 K108 C^α与氧负离子的氢键形成，导致氧负离子稳定机制受损。此外，K108 的侧链对 UFC1 活性至关重要，其参与形成活性位点附近的凹槽，有助于底物赖氨酸的攻击和反应进行。
4. UFC1 存在额外的氧负离子洞：尽管 UFC1 T106I 突变体在氧负离子稳定机制上存在缺陷，但仍有较强的单 UFM1 化现象。研究发现，UFC1 存在一个不依赖 TAK 基序的氧负离子洞，由 L117 和 T118 的主链形成，可促进 UFC1 的分子内 UFM1 化，主要发生在 K122 和 K108 位点。而依赖 TAK 基序的氧负离子洞则对依赖 E3 连接酶的 UFM1 化至关重要。
5. HPN 依赖的氧负离子洞需要构象变化：研究人员对含有 HPN 基序的 E2 酶进行研究，发现通过 Cys - Glu 突变模拟氧负离子中间体时，Glu 侧链在这些 E2 酶中的构象不适合与 HPN 基序中 Asn 的 C^α形成氢键。进一步研究表明，与 E3 连接酶相互作用可限制 E2 - Ub/UBL 复合物的构象，促进形成有利于氧负离子稳定的封闭构象。同时，将 HPN 基序引入 UFC1 后，UFC1 无法进行有效的转 UFM1 化，因为 UFC1 的长螺旋结构阻碍了 HPN 基序中 His 侧链与 Asn 形成关键氢键。

研究结论与讨论

这项研究通过对 UFC1 的深入探究，揭示了 E2 结合酶中氧负离子洞的多因素和可塑性本质。研究表明，氧负离子的稳定不仅依赖于传统的氢键，C^α氢键也起着重要作用。UFC1 利用两种不同类型的氧负离子洞，分别在转 UFM1 化和分子内 UFM1 化过程中发挥作用，这一发现为理解 E2 酶的催化机制提供了新的视角。同时，研究还发现 UFC1 T106I 突变体的缺陷与 K108 C^α的高流动性有关，这为开发潜在的治疗药物提供了新的靶点，有望通过限制 K108 C^α的运动来克服 T106I 突变带来的缺陷。此外，研究还对含有 HPN 基序的 E2 酶进行了探讨，发现它们也可能存在类似的氧负离子稳定机制，但需要特定的构象变化。这些研究成果为进一步深入研究蛋白质泛素化修饰机制奠定了坚实的基础，对理解细胞生理过程和相关疾病的发生发展机制具有重要意义。