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疟疾防控面临困境，研究人员开展针对非洲疟疾媒介冈比亚按蚊的基因驱动研究，构建靶向 mir-184 的 miR-184D 基因驱动。结果显示其能降低蚊子适应性、传播抗疟效应基因。这为疟疾防控提供新策略，有望推动疟疾根除进程。
在疟疾防控的漫长征程中，近年来遭遇了重重阻碍。过去十年，全球疟疾防控工作停滞不前，2022 年全球疟疾病例数高达 2.49 亿，丝毫没有下降的趋势。尽管 RTS,S/AS01 疟疾疫苗已推广，双成分杀虫剂处理过的蚊帐也已普及，但世界仍未走上实现 2016 - 2030 年全球疟疾技术战略目标的正轨。在非洲，城市疟疾媒介的兴起，以及广泛存在的药物、诊断和杀虫剂抗性问题，更是让疟疾防控雪上加霜。在这样的严峻形势下，开发新的疟疾防控工具和策略迫在眉睫。
为了攻克疟疾防控难题，伦敦帝国理工学院（Department of Life Sciences, Faculty of Natural Sciences, Imperial College London）的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦于基因驱动技术，试图利用这一前沿技术找到疟疾防控的新突破口。研究人员构建了一种靶向非编码基因 mir-184 的基因驱动（miR-184D），并对其进行了全面研究。最终发现，miR-184D 基因驱动在实验室条件下能够有效传播并固定在种群中，显著降低蚊子种群的适应性，同时还能传播抗疟效应基因，这一成果为疟疾防控带来了新的希望。相关研究成果发表在《Nature Communications》杂志上。
研究人员开展此项研究，主要运用了以下几种关键技术方法：
- 基因编辑技术（CRISPR）：利用 CRISPR 技术构建靶向 mir-184 的基因驱动载体，通过设计 gRNA 靶向成熟 miR-184 的保守区域，实现对基因的精准编辑。
- 转录组分析技术：对糖喂养的雌性蚊子进行转录组分析，研究 miR-184D 基因驱动对基因表达的影响，从而挖掘其潜在的作用机制。
- 种群笼实验：在笼子中模拟自然环境，研究 miR-184D 基因驱动在种群中的传播和对蚊子种群适应性的影响。
- 数学建模：使用 EMOD 框架进行模拟，评估 miR-184D 基因驱动在野外对疟疾传播的影响，预测不同参数组合下的防控效果。
下面详细介绍研究结果：
- 基因驱动构建及传递效率：研究人员构建了 miR-184D 基因驱动载体，将 Cas9 置于 zpg 生殖系启动子的转录控制下，并表达靶向成熟 miR-184 保守部分的 gRNA。获得转基因品系 miR-184D 后发现，纯合子的雄性和雌性个体均可存活且具有生育能力。进一步研究发现，miR-184D 在雌雄个体中的传递率近乎最优（♀99.6%，♂97.1%），且雌性的传递率显著高于雄性。同时，在转基因个体的中肠和幼虫中观察到意外的 GFP 表达，这表明附近的 mir-184 顺式调控元件影响了转基因的表达。此外，通过对 miR-184 miRNA 水平的定量分析发现，成熟 miR-184 在 miR184D/miR184D 雌性个体的全身中检测不到，在杂合子载体中也严重减少。
- miR-184D 对蚊子寿命和飞行能力的影响：研究人员对蚊子的适应性和生活史特征进行了评估。在果蝇中，miR-184 被报道与生殖系分化和雌性生育能力有关，但在本研究中，对 miR-184D 杂合子和纯合子个体的各种杂交实验表明，其对蚊子的生育力和繁殖力没有显著影响，在未成熟阶段也未发现明显的发育影响。然而，令人惊讶的是，大量纯合成年 miR-184D 个体（高达 40%）无法自发启动或维持飞行。对未表现出飞行启动缺陷的杂合子和纯合子 miR-184D 个体进行飞行能力测试发现，纯合子雌性的飞行能力至少有所下降，而雄性则没有。此外，研究还发现，糖喂养的纯合子雄性和雌性 miR-184D 蚊子的寿命（中位数分别为 20 天和 25 天）明显短于野生型对照（中位数分别为 32 天和 35 天），杂合子个体的寿命也有较小但显著的缩短。为了排除 GFP 表达对蚊子适应性的影响，研究人员构建了缺乏 GFP 标记模块的品系 miR-184，结果发现该品系的蚊子同样存在飞行能力下降和寿命缩短的现象，表明这些表型与 miR-184 的缺失有关，而不是 GFP 的过表达。不过，miR-184d 纯合子的蛹发育比 miR-184D 纯合子更快，这表明 GFP 表达可能也存在额外的成本。
- miR-184D 蚊子经历血餐相关应激：研究人员进行了疟原虫感染实验，虽然 miR-184 在中肠中大量表达，但他们假设 miR-184D 雌性在支持寄生虫感染的能力上与野生型雌性没有差异。实验结果也证实，在感染伯氏疟原虫或恶性疟原虫后，miR-184D 和野生型雌性的卵囊负荷、卵囊直径或子孢子强度没有显著差异。然而，在实验过程中发现，miR-184D 蚊子在血餐后死亡率很高，无论是感染还是未感染的血液来源都会导致这种情况。进一步研究发现，不同来源的血液（包括人血、热灭活血清的人血以及牛血）都会使 miR-184D 雌性的死亡率显著高于野生型雌性。但单独的糖剥夺或糖和水的完全剥夺（在没有血餐的情况下）并不会导致 miR-184D 雌性死亡率增加。通过百草枯挑战实验发现，野生型和 miR-184D 雌性在百草枯暴露增加时的死亡率相似，这表明血餐诱导的氧化应激可能不是 miR-184D 雌性观察到的死亡率的主要原因。再次进行血餐实验时发现，当糖始终可供应给 miR-184D 雌性时，血餐后的即时死亡率（8 天内）会降低。这些实验表明，血餐对 miR-184D 蚊子是一个显著的应激源，且蚊子的营养状况可能会显著调节血餐对其生存的影响。
- miR-184D 中肠溶质运输的转录扰动：为了深入了解 miR-184D 蚊子的各种表型，研究人员对糖喂养的雌性蚊子进行了转录组分析，分析了解剖的中肠和剩余胴体中的基因表达水平。结果发现，与野生型雌性相比，纯合子 miR184D 雌性中肠的转录变化更为显著，这与 miR-184 在该组织中的高表达预期相符。基因本体（GO）富集分析表明，溶质运输是 miR-184D 纯合子中肠中受干扰最严重的过程，一系列预测的氨基酸、糖、单羧酸、维生素、水（水通道蛋白）和离子转运体显著上调。有趣的是，分析这些基因的组织特异性表达时发现，通常在马氏管中富集表达的基因在 miR-184D 雌性中肠的显著上调基因中过度表达。研究人员还在中肠样本的上调基因中寻找预测的 miR-184 靶基因，发现 20 个预测的高置信度 miR-184 靶基因在中肠样本的显著上调基因中，其中隔膜连接（GO:005918）是最显著富集的 GO 术语。在下调基因中，包括已知的解毒因子硫氧还蛋白过氧化物酶 4（TPX4，AGAP011824），鸟氨酸脱羧酶（ODC）活性是中肠中唯一显著富集的 GO 术语。此外，通过转录组数据集分析转基因表达水平发现，miR-184D 中肠样本中 GFP 表达水平较高，胴体中较低，但未观察到 Cas9 表达水平的类似调节。
- miR-184D 种群入侵实验：研究人员在六个独立的笼子种群中研究了 miR-184D 的自主传播及其动员抗疟有效载荷修饰（能够进行非自主基因驱动）的能力。与经典的抑制性基因驱动不同，miR-184D 蚊子纯合子是可行且可育的，能够大量饲养用于大规模释放。实验开始时，在三个笼子种群中分别放入 500 只个体（50 只♂，50 只♀的纯合转基因蚊子和 200 只♂，200 只♀的野生型蚊子），使 miR-184D 的起始等位基因频率达到 20%；另外三个笼子种群除了 miR-184D 外，还包含 MM-CP 转基因，起始等位基因频率也为 20%。研究人员监测了两个转基因的频率随时间的变化，并记录了每个世代的笼子产卵量。实验初期，6 个笼子种群中有 5 个种群中 miR-184D 转基因载体的比例下降，这可能是由于 miR-184D 个体的纯合适应性较低，导致其在交配中的参与度降低和第 0 代的产卵量减少。随后，所有笼子种群中的两个转基因都增加并在大约第 14 代达到固定。在第 20 和 21 代对所有 6 个笼子的组成进行重新评估时发现，在第 21 代，通过 DNA 测序对所有大小与驱动等位基因不匹配的 miR-184D 和 CP 等位基因进行详细分析，在 6 个笼子种群中均未检测到野生型等位基因，在 552 个筛选个体中只有 1 个个体没有携带至少一个 miR184D 等位基因。对于 miR-184D，两个笼子种群存在非驱动等位基因，最常见的是一个 5 碱基对缺失突变；对于 CP 位点，在笼子种群 5 和 6 中检测到低频非驱动等位基因，DNA 测序显示最常见的变异等位基因是 GATT 基序的三倍体，可能是 CP 5′ UTR 的功能性预先存在的罕见变异。总体而言，6 个笼子种群的产卵量在各代之间波动较大，且趋势相似，这表明在长达一年的实验中，血液来源或其他无法控制的环境参数对种群生产力有很大影响。尽管如此，miR-184D 驱动的传播及其最终固定导致产卵量随时间相应稳定下降，且 miR-184D 在所有 3 个笼子种群中都能高效传播抗疟效应基因 MM-CP。
- 基因驱动和疟疾传播模型：研究人员使用 EMOD 框架进行模拟，评估在实验室中观察到的 miR-184D 驱动表型在野外对疟疾传播的影响。在模拟中，考虑了不同程度的可能抗性和 miR184D 在野外环境中显示的表型水平，评估了一系列参数组合。假设驱动的遗传率为 99%，改变功能性（R1）与非功能性抗性等位基因（R2）的比例（R1 评估值：0.1%，0.01%，0.001%），将 miR-184 功能丧失（LOF）对适应性的潜在不同影响建模为纯合子（相对于功能性 miR184 纯合子，成年每日死亡率增加 1 - 2.5 倍）和杂合子（影响降低 50%：1 - 1.75 倍）的成年每日死亡率增加，以及纯合子 miR-184 功能丧失基因型的蚊子在每次血餐时的死亡率（0 - 100%）。在模拟开始 200 天后，单次释放 1000 只 miR-184D 纯合子雄性蚊子，然后在 5 年内评估其对 0 - 5 岁儿童临床疟疾病例的减少以及当地疟疾负担消除的概率，模拟了三种不同的媒介密度情景（每人每年约 15、35 或 65 次感染叮咬），并对 40 次随机模拟进行平均。结果预测，在功能性抗性较低且每日和血餐诱导的死亡率综合效应为中度或低度的情况下，miR-184D 驱动能够固定并达到稳定状态；只有在血餐死亡率为 100% 且功能性抗性较低（0.001%，207 次模拟）或中等（0.01%，3 次模拟）时，蚊子种群才会根除。在驱动能够有效传播的死亡率水平下，增加的每日死亡率，尤其是与性别相关的血餐死亡率，会降低能够存活足够长时间以传播寄生虫的雌性蚊子的比例。在高功能性抗性情景下，这种更有针对性的适应性成本降低了对功能性抗性的选择压力，从而对疟疾病例产生了更高的总体影响。通过对一系列参数的建模，发现 miR-184 功能丧失对种群水平的适应性影响通常能够根除当地的疟疾负担，并在释放后的 5 年内显著减少临床病例。
研究结论和讨论部分指出，目前还没有基因驱动在环境中进行测试，但对于按蚊来说，基因驱动技术已在实验室取得显著成果。在本研究中，研究人员设计了一种结合种群抑制和种群修饰的基因驱动策略，选择高度保守且在中肠高表达的 miR-184 作为靶基因。实验发现，miR-184D 基因驱动引发了一系列负面适应性效应，如缩短成年蚊子寿命、降低飞行能力以及使其难以应对血餐压力，但对蚊子的生育力没有影响，且基因驱动率较高。通过种群笼实验证明，miR-184D 构建体能够迅速入侵冈比亚按蚊种群并固定下来，导致种群适应性降低。不过，miR-184D 蚊子复杂的适应性特征在野外条件下的表现难以预测，需要进一步研究来剖析其复杂的适应性效应，并在半野外条件下评估其适应性，同时确定靶向 RNA 基因的策略在降低功能性抗性出现可能性方面的有效性。如果大规模实验表明功能性抗性发生率较低，那么结合多种适应性效应将有效降低疟疾传播。此外，miR-184D 驱动不仅具有抑制种群的作用，还能传播抗疟效应基因，实现了种群抑制和修饰的进一步结合。而且，miR-184 基因在冈比亚按蚊中肠的高表达，使其位点适合直接表达抗疟效应基因，有望构建单一位点的抑制 - 修饰构建体。综上所述，本研究描述的靶向 miR-184 的基因驱动具有吸引人的特性，能够整合种群抑制和种群修饰的多个方面，作为疟疾控制的候选菌株，值得进一步评估和研究，为疟疾防控提供了新的思路和潜在工具，有望在未来的疟疾防控工作中发挥重要作用。
