突破技术瓶颈：流感病毒感染细胞的纳米级微观奥秘大揭秘

在流感病毒感染研究中，因病毒 - 细胞界面早期事件的时空动力学难以探究，研究人员开发新方法固定甲型流感病毒（IAV），研究其与细胞的相互作用。结果发现 IAV 可诱导纳米级细胞重编程，该成果为研究早期病毒感染提供新思路。

　　流感，这个我们并不陌生的疾病，每年都会引发大量的流行，时不时还会带来全球性的大流行，严重威胁着人类的健康。甲型流感病毒（Influenza A viruses，IAV）就是引发这些麻烦的 “罪魁祸首” 之一。在病毒感染细胞的过程中，单个病毒粒子会在病毒 - 细胞界面（virus - cell interface）触发特定的细胞信号传导，这个界面是细胞膜与病毒直接接触的纳米级区域。然而，病毒诱导的受体招募和细胞激活是发生在纳米级尺度、几分钟内的短暂过程。由于技术的限制，这些早期事件的时间和空间动态变化一直都不太清楚。为了弄清楚这些关键问题，来自德国亥姆霍兹感染研究中心（Helmholtz Centre for Infection Research）等多个机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们揭示了甲型流感病毒感染细胞的新奥秘。

研究人员为了突破技术瓶颈，开发了一种新的实验方法。他们先将未修饰的甲型流感病毒共价固定在玻璃表面，然后再与活的上皮细胞接触。这样一来，就延长了病毒与细胞膜相互作用的观察时间，同时最大程度减少了对病毒的修饰，便于对病毒 - 细胞的相互作用进行实时成像研究。在这个过程中，研究人员用到了多种关键技术方法，主要包括单分子超分辨率显微镜技术，其中就有基于单分子定位的光激活定位显微镜（photoactivated localization microscopy，PALM）和随机光学重建显微镜（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM），通过这些技术能够在纳米尺度上对病毒与受体的相互作用进行精准观测；还有活细胞全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscopy，TIRF），用来观察细胞内蛋白的动态变化 。

研究结果主要有以下几个方面：

• 未修饰的 IAV 可与玻璃底物共价连接并支持活细胞附着：研究人员通过化学修饰玻璃盖玻片，成功实现了将天然病毒共价固定在上面，并让活细胞能够附着生长。他们先在盖玻片上涂上硅烷 - PEG₅₀₀₀-NHS 连接子，使其能与病毒包膜蛋白上的伯胺反应，同时用硅烷 - PEG₂₀₀降低连接子密度，避免病毒聚集。之后又通过添加含有精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸基序的环五肽（Cyclo (-RGDfK)，cRGD），促进了活细胞的附着，构建出稳定的病毒 - 细胞界面，为后续研究奠定了基础。
• 固定化的 IAV 以唾液酸依赖的方式招募 EGFR：为了探究表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在 IAV 感染中的作用，研究人员将荧光标记的 IAV 固定在玻璃表面，培养表达 EGFR - GFP 的 A549 细胞。利用 TIRF 显微镜观察发现，EGFR - GFP 信号在病毒颗粒附近积累，而且这种积累依赖于 HA - 唾液酸相互作用，用唾液酸酶处理细胞后，积累现象消失。进一步使用 PALM 技术研究发现，病毒结合会使 EGFR 在病毒 - 细胞界面的扩散速度减慢，且这种减慢与唾液酸有关，同时还观察到 EGFR 在该界面存在动态交换现象。
• 固定化的 IAV 招募网格蛋白介导的内吞作用相关蛋白：IAV 感染的一个重要步骤是诱导内吞作用，使病毒颗粒进入宿主细胞细胞质。研究人员通过培养表达 epsin1 - GFP 的 A549 细胞，利用 TIRF 显微镜观察发现，部分固定化的 IAV 与 epsin1 共定位。同时，使用表达 AP2 - RFP 和网格蛋白轻链 A（Clathrin light chain A，ClC） - GFP 的细胞进行实验，证实 IAV 会招募 AP2 到细胞膜，而且在 10 分钟的监测过程中，发现 ClC - GFP 和 AP2 - RFP 的荧光信号存在波动，表明病毒与细胞内吞机制存在反复的相互作用。
• 固定化的 IAV 导致细胞肌动蛋白细胞骨架的局部重新分布：细胞膜下的肌动蛋白细胞骨架在许多细胞过程中都起着关键作用。研究人员通过用 Alexa647 - 鬼笔环肽标记细胞 F - 肌动蛋白，利用 TIRF 和 STORM 显微镜观察发现，约 15% 的 IAV 周围存在 F - 肌动蛋白的明显积累，且其纳米级组织结构呈现多样化，包括斑点、孔洞和环状等结构。通过对表达 LifeAct - GFP 的细胞进行活细胞成像，也观察到了类似的动态结构变化，表明固定化的 IAV 会诱导局部 F - 肌动蛋白的重新组织。

研究结论和讨论部分，此次研究开发的方法能够在单病毒水平上研究感染病毒与宿主细胞之间的早期相互作用，这是非常有意义的。通过研究，发现了 IAV 感染过程中的一些关键现象，比如 IAV - EGFR 相互作用的动态变化、网格蛋白介导的内吞作用相关蛋白的招募以及肌动蛋白细胞骨架的局部响应等。虽然目前对于某些现象的具体机制还不完全清楚，比如 AP2 在 IAV 进入细胞过程中的具体作用及与其他衔接蛋白的相互作用，但该研究为进一步探索早期病毒感染过程，包括受体特异性和细胞嗜性等方面提供了重要的基础，也为感染研究领域在单细胞水平的研究开辟了新的方向。