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在人类基因组研究中，转座元件（TEs）检测困难。研究人员开展了利用纳米孔测序和 RetroInspector 分析 TEs 的研究。结果显示，RetroInspector 检测精度超 80% 。该研究为探索 TEs 在遗传和疾病中的作用提供了有力工具。
在浩瀚的生命科学领域，人类基因组一直是科学家们探索的重要对象。转座元件（TEs）作为基因组的重要组成部分，约占人类基因组的 45%，却如同隐藏在基因组中的 “暗物质”，给科研工作带来诸多挑战。TEs 具有高度的移动性，能够在基因组中跳跃到不同位置，这不仅使它们成为遗传变异的重要来源，还参与了基因调控、疾病发生等关键生物学过程 。然而，由于 TEs 的多样性、重复性以及进化机制的复杂性，其检测难度极大。传统的短读长测序（SRS）方法在面对 TEs 时，犹如雾里看花，难以准确识别和分析。尽管长读长测序（LRS）技术的出现为 TEs 检测带来了曙光，但与之相匹配的生物信息学工具却极为匮乏，这严重制约了对 TEs 的深入研究。因此，开发一种高效、全面的 TEs 分析工具迫在眉睫。
在这样的背景下，来自西班牙穆尔西亚大学（Universidad de Murcia）的研究人员 Javier Cuenca - Guardiola、Belén de la Morena - Barrio、Javier Corral 和 Jesualdo Tomás Fernández - Breis 开展了一项重要研究。他们开发了 RetroInspector，这是一款基于纳米孔测序数据的综合性分析工具，能够对 TEs 进行检测、注释、富集分析和基因分型。相关研究成果发表在《Scientific Reports》上，为人类基因组中 TEs 的研究开辟了新道路。
研究人员在开发 RetroInspector 时，采用了一系列先进的技术方法。首先，利用 minimap2 将纳米孔测序得到的碱基序列与人类参考基因组版本 GRCh38 进行比对，随后使用 samtools 对得到的比对结果进行排序和索引，生成 BAM 格式的比对文件。在变异检测环节，选择 cuteSV 和 Sniffles2 软件进行变异检测，生成 VCF 文件，并根据读取证据对变异进行筛选。对于插入序列，研究人员借助 pysam 从支持读取中检索并使用 spoa 库进行重组装；而对于删除变异，则运用 SURVIVOR 软件进行合并和筛选。此外，研究人员还运用 RepeatMasker、BLAST 等工具对 TEs 进行识别和注释，并通过 R 语言中的多个包进行基因富集分析。研究过程中使用了多个样本队列，包括来自 PromethION 测序的样本、HGSV（Human Genome Structural Variation Consortium）的样本等。
下面来详细看看研究结果：
- 验证和基准测试：研究人员通过 PCR 扩增和测序对 RetroInspector 的变异检测性能进行了验证。在之前工作流程的基础上，对 17 个插入进行验证，其中 14 个（82.4%）得到确认；在本次研究中，对 20 个插入进行实验验证，15 个（75%）得到验证。通过与包含 5630 个 TE 插入的真值集对比，发现 cuteSV 和 Sniffles2 的组合与 HGSV 数据集的一致性更好。在严格标准下，对 HGSVC 研究分类为 TEs 的子集，检测精度高于 80%；考虑所有插入时，精度高于 85%。
- 基因型基准测试：RetroInspector 利用读取证据和覆盖度数据计算插入的基因型。通过对 HGSV2 队列的测试，发现其结果与真值集高度一致，所有变异检测软件组合的精度均超过 95%，其中 cuteSV 和 Sniffles2 组合的最佳精度达到 96.99%。
- 边缘假阴性和合并分析：研究人员分析了同卵双胞胎的样本，发现大部分样本特异性插入位于嘈杂的基因组区域，或是由于插入等位基因代表性不足等原因导致。通过调整合并距离等参数，可以减少样本特异性插入的数量。
- 时间使用和可扩展性：研究发现，比对是最耗时的步骤，而 RetroInspector 在处理相同样本时，比另一种长读长 TE 检测软件 PALMER 耗时更短，且能生成更完整的分析结果。例如，RetroInspector 处理三个 HGSVC 样本仅需 1005.14 分钟，而 PALMER 则需要 4605.15 分钟。
- 反转录转座特征识别：研究人员探索了反转录转座的两个关键特征 —— 插入序列末端的 polyA 尾巴和 L1 内切酶靶序列的共有基序。虽然这些特征能提高检测精度，但会降低召回率，整体 F1评分有所下降。
- TE 插入和缺失的识别：在对 24 例抗凝血酶（AT）缺乏患者的样本分析中，共鉴定出 6714 个 TE 插入，其中 Alu 和 SVA 插入最为常见。此外，还发现了一些与疾病相关基因的插入，如在 SERPINC1 基因中发现了 SVA 插入。
- 插入序列的重组装：RetroInspector 会检索支持插入的读取，并对受影响区域进行重组装，以获得新的序列。在重组装过程中，会排除长度差异过大的读取，以减少噪声影响。
- TE 插入和缺失的基因分型：RetroInspector 利用覆盖度和读取支持数据计算插入的基因型，进而确定样本中的等位基因频率。通过将基因型与严格和宽松数据集进行比较，可以筛选出可能的错误插入。
- 样本比较：RetroInspector 能够比较成对样本，识别出样本间共有的和独特的 TE 插入，并对其进行注释。例如，在比较 NA19240 和 HG00514 两个样本时，发现它们共有 870 个 TE 插入，同时存在 2361 个非共有的插入。
研究结论和讨论部分指出，RetroInspector 为研究 TE 插入提供了一个高效、便捷的流程。它基于 Snakemake 构建，具有自动安装依赖项、可重复性强和用户友好等优点。通过对不同样本的分析，研究人员发现 RetroInspector 不仅能够检测到活跃的 TE 插入，还能识别出不活跃的 I 类和 II 类元件插入，尽管对这些不活跃元件插入的解释更为复杂，但研究人员通过实验验证了它们并非由比对错误导致。此外，RetroInspector 的注释和富集分析功能，能够帮助研究人员了解 TE 插入对基因和功能的影响，这对于研究癌症等疾病的发生机制具有重要意义。与其他工具相比，RetroInspector 在检测精度和时间消耗方面表现出色，为人类基因组中 TEs 的研究提供了有力支持。然而，研究也存在一定的局限性，如未能对 xTea 工具进行比较评估。未来，随着对 TEs 研究的不断深入，RetroInspector 有望在揭示人类遗传变异、探索疾病机制等方面发挥更大的作用，为生命科学和健康医学领域的研究提供更深入的见解。
