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疟疾严重威胁人类健康，为探究疟原虫感染机制，研究人员以伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）为对象，研究环子孢子蛋白（CSP）泛素化作用。结果发现 CSP 在 K252 和 K258 位点泛素化可助疟原虫逃避宿主自噬清除，这为抗疟药物研发提供了新靶点1218。
疟疾，这一古老的传染病，至今仍在全球肆虐，尤其是撒哈拉以南非洲地区，严重威胁着人们的健康。疟原虫是疟疾的病原体，当被感染的雌性按蚊叮咬人类后，疟原虫的感染形式 —— 子孢子会迁移到肝脏，在肝细胞中发育繁殖，产生能感染红细胞的裂殖子，进而引发疾病症状。因此，了解疟原虫在肝脏感染阶段的生存机制，对于开发有效的抗疟策略至关重要。此前，虽然对疟原虫的研究取得了一些进展，但疟原虫环子孢子蛋白（CSP）的泛素化修饰在肝脏感染早期的作用却一直未被完全揭示。
为了深入探究这一问题，来自葡萄牙古尔本基安分子医学研究所（1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine）等机构的研究人员开展了相关研究。他们发现，CSP 的泛素化在疟原虫肝脏感染早期起着关键作用，尤其是在 K252 和 K258 这两个赖氨酸残基位点的泛素化，能够帮助疟原虫逃避宿主的清除，确保肝脏感染阶段的顺利进行。这一发现为理解疟原虫的感染机制提供了新的视角，也为开发针对肝脏感染阶段的抗疟药物提供了潜在靶点，对全球抗疟工作具有重要意义。该研究成果发表在《Scientific Reports》杂志上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是免疫沉淀和蛋白质印迹技术，用于检测 CSP 的泛素化水平；二是质谱分析技术，用于鉴定 CSP 泛素化的位点；三是基因编辑技术，构建了特定赖氨酸残基突变的疟原虫转基因系；四是免疫荧光成像技术，观察相关蛋白的表达和定位。
下面来看具体的研究结果：
- Pb CSP 被宿主肝细胞泛素化：研究人员用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理感染疟原虫子孢子的 HepG2 细胞，通过免疫沉淀和蛋白质印迹实验发现，只有在蛋白酶体被抑制时，才能观察到 PbWT 感染的 HepG2 细胞中 CSP 的积累，这表明 Pb CSP 能被宿主肝细胞泛素化。在人工泛素化系统中，也观察到类似现象，且发现只有一小部分泛素化的 CSP 会被 26S 蛋白酶体降解345。
- 哺乳动物 E3 Cullin RING Ligases 可介导 Pb CSP 泛素化：E3 泛素连接酶在泛素化过程中起关键作用，其中 E3 Cullin RING Ligases（CRLs）是研究较多的一类。研究人员使用 CRL 抑制剂 MLN4924 处理感染的 HepG2 细胞，发现 CSP 泛素化水平降低，表明宿主 CRLs 参与了 Pb CSP 的泛素化。进一步研究发现，CUL1 与 Pb CSP 相互作用并可能使其泛素化，但敲低 CUL1 蛋白水平并不影响疟原虫肝脏感染的早期阶段678。
- Pb CSP C 末端区域的 K252 和 K258 是关键的泛素化靶点：研究人员设计了一系列 CSP 突变体，通过实验发现，C 末端赖氨酸残基突变的 pHA-PbCSPK-CT-R 突变体中，CSP 的多泛素化水平明显降低。利用质谱分析确定了 K252 和 K258 为潜在的泛素化位点，进一步突变验证表明，这两个位点的突变会影响 CSP 的泛素化，但可能还有其他赖氨酸残基参与泛素化过程91011。
- 宿主介导的 Pb CSP K252 和 K258 位点泛素化确保疟原虫在肝脏早期存活：研究人员构建了 Pb CSP K252 和 K258 突变为精氨酸的转基因疟原虫系 PbCSPK-252/258-R 和对照系 PbCSPControl。实验表明，K252/K258R 替换不影响疟原虫的孢子生殖、滑行和入侵能力，但会导致肝脏感染早期疟原虫感染负荷显著降低，说明 CSP 在 K252 和 K258 位点的泛素化对疟原虫在肝脏早期的存活至关重要121314。
- 缺乏适当的 Pb CSP 泛素化使疟原虫易被宿主自噬机制清除：研究发现，PbCSPK-252/258-R 突变体在肝脏感染早期更容易被清除，且感染该突变体的肝细胞中，自噬相关蛋白 LC3 和溶酶体相关膜蛋白 LAMP1 的水平显著增加。使用自噬抑制剂氯喹（CLQ）处理后，突变体的感染水平得到恢复，表明 Pb CSP 在 C 末端 K252 和 K258 位点的泛素化是避免疟原虫在肝细胞入侵早期被溶酶体清除的关键151617。
综上所述，研究结论表明，Pb CSP 在 K252 和 K258 位点的泛素化缺失会导致疟原虫在肝脏感染早期被清除的比例增加，可能是通过自噬机制实现的。因为在 Pb CSP 赖氨酸突变的疟原虫中，观察到自噬相关蛋白（LC3）和溶酶体反应相关蛋白（LAMP1）的积累，而干扰自噬途径则能维持肝脏内疟原虫的存活。这一研究成果拓展了人们对 CSP 蛋白翻译后修饰重要性的理解，强调了深入研究疟原虫红细胞外期发育过程中泛素化的潜在意义，为发现肝脏内抗疟干预的潜在靶点提供了新的思路，有望推动抗疟药物的研发进程，为全球疟疾防控带来新的希望。
