靶向 NL63 冠状病毒刺突蛋白的强效中和单克隆抗体：解锁 α 冠状病毒防治新密码

为探究人体对 NL63 冠状病毒的免疫反应，开发有效防治手段，研究人员开展针对 NL63 刺突蛋白的研究。他们分离出多种单克隆抗体（mAbs），明确其中和活性与作用位点。这为 α 冠状病毒疫苗和疗法开发提供关键依据。

　　在过去 20 年里，高致病性冠状病毒多次跨界传播，严重威胁人类健康。如今，SARS-CoV-2 已与其他四种人类冠状病毒一同在人群中流行，这些冠状病毒大多会引发季节性的上呼吸道感染。其中，NL63 冠状病毒虽通常导致轻度呼吸道疾病，却与高致病性的 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 使用相同的细胞受体 —— 血管紧张素转化酶 2（ACE2）受体。它自 2004 年被发现后，其潜在威胁引发关注。尽管目前它致病性较低，但曾有引发儿童严重下呼吸道感染的报道，且冠状病毒在蝙蝠中存在重组现象，可能导致新的人畜共患病原体出现，因此有必要深入研究，为应对潜在的疫情威胁做好准备。

墨尔本大学彼得?多尔蒂感染与免疫研究所等机构的研究人员开展了针对 NL63 冠状病毒刺突蛋白的研究。他们发现了多种针对 NL63 刺突蛋白的单克隆抗体，部分抗体具有强效的中和活性，这为开发针对 α 冠状病毒的疫苗和治疗方法提供了重要依据，相关研究成果发表在《npj Viruses》上。

研究人员采用了多种关键技术方法：招募 14 名健康成年人组成队列（样本队列来源），获取血浆和外周血单个核细胞（PBMCs）；运用流式细胞术检测记忆 B 细胞；通过多重逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和桑格测序从单个 B 细胞中分离并表达单克隆抗体；利用活病毒中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）等评估抗体活性和结合特性；借助病毒逃逸试验和下一代测序确定抗体中和表位；进行序列分析研究 NL63 刺突蛋白的保守性。

研究结果

1. 体液免疫反应：研究人员检测了 14 名健康成年人对 NL63 刺突蛋白的抗体和 B 细胞反应。结果显示，所有受试者血浆中均检测到针对全长刺突蛋白和 S1_B（RBD）的 IgG 结合，血浆中和活性的 IC₅₀滴度在 1:29 至 1:745 之间。同时，检测到针对 NL63 刺突蛋白的记忆 B 细胞（MBCs），但其频率显著低于针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白的记忆 B 细胞123。
2. 单克隆抗体的分离与特性：从两名具有高频率刺突特异性记忆 B 细胞和强效血浆中和滴度的受试者中，分选 NL63 刺突或 NL63 S1_B特异性的单个记忆 B 细胞，获得 97 条重链和 44 条轻链序列，并选择部分重轻链对表达为单克隆抗体。通过 ELISA 评估这些单克隆抗体与 NL63 刺突蛋白及其亚结构域的反应性，发现 8 种单克隆抗体结合全长刺突蛋白，5 种特异性结合 S1_B结构域45。
3. 中和活性：对结合刺突蛋白的单克隆抗体进行针对活 NL63 病毒的中和活性筛选，发现 5 种单克隆抗体具有中和活性，IC₅₀值在 4.9 ng/ml 至 448.9 ng/ml 之间。其中 4 种结合 S1_B的单克隆抗体可阻断重组 ACE2 与 S1_B的结合，表明其通过直接阻断细胞受体识别实现病毒中和；而 NLH02 单克隆抗体虽不阻断 ACE2 结合，但能以与 S1_B单克隆抗体相当的效力中和所有 NL63 分离株6。
4. 中和表位定位：通过在中和单克隆抗体存在下对 NL63 病毒进行连续传代，产生逃逸变异体。对逃逸变异体进行测序和分析，发现针对 S1_B的中和单克隆抗体的逃逸突变集中在 NL63 RBD 的三个不连续的受体结合基序环上；而针对非 S1_B的 NLH02 单克隆抗体，其逃逸突变出现在 S2 亚基的膜近端 HR2 区域，提示其可能通过干扰病毒融合机制实现中和789。
5. 刺突蛋白的序列保守性：研究人员分析了 1983 年至 2023 年间超过 200 个 NL63 病毒分离株的基因组序列，发现 NL63 刺突蛋白的序列差异有限，大部分变异集中在 S1₀和 S1_A结构域。S1_B（RBD）相对保守，病毒逃逸突变在现有基因组序列中未被观察到，且潜在结合位点的大多数周围残基具有较强的序列保守性。此外，α 冠状病毒的 S2 亚基中 HR1 和 HR2 区域通常比 β 冠状病毒长 14 个氨基酸，NLH02 在 HR2 区域的潜在表位在 α 冠状病毒中保守性不佳，且在 β 冠状病毒中不存在1011。

研究结论与讨论

研究人员成功分离出针对 NL63 冠状病毒刺突蛋白的多种单克隆抗体，其中 5 种具有中和活性，4 种靶向受体结合结构域（RBD），1 种靶向 S2 亚基的 HR2 区域。这一发现不仅加深了对人体针对 α 冠状病毒刺突蛋白免疫识别的理解，还为后续开发针对 α 冠状病毒的疫苗和单克隆抗体疗法提供了重要方向。然而，该研究也存在一定局限性，如缺乏体内保护效力数据，且尚未建立有效的动物模型评估疫苗和疗法的保护能力。尽管如此，鉴于类似的针对其他冠状病毒的 RBD 单克隆抗体在体内具有保护作用，以及针对 HR2 区域的 S2 中和单克隆抗体在其他冠状病毒感染模型中显示出治疗效果，研究人员认为这些单克隆抗体在体内可能具有保护作用。未来，仍需进一步研究如何设计更有效的疫苗和疗法，以应对未来可能出现的 α 冠状病毒威胁，加强对这类病毒的防控准备。