高压处理新冠灭活疫苗的开发与体内评估：推动全球疫苗公平的新希望

本文聚焦新冠疫苗开发，探究高压（HHP）技术制备灭活疫苗的效果。研究发现，500MPa 处理的疫苗免疫原性强，4°C 可保存 30 天，能降低冷链依赖。HHP 技术有望解决疫苗公平性问题，为全球疫苗开发带来新契机。

　　

引言

疫苗是医学和公共卫生领域的有力武器，能将曾极具危害的疾病转化为可预防疾病。新冠疫情凸显了疫苗开发的重要性，多种疫苗平台应运而生，且已证实可有效降低发病率和死亡率。然而，新冠疫苗在全球的分配存在严重不平等，低收入和中等收入国家（LMICs）在疫苗获取和接种覆盖上远远落后于高收入国家（HICs），这不仅导致可避免的死亡，还延长了疫情。

开发低成本且热稳定的疫苗生产策略对实现全球健康公平至关重要。高压处理（High Hydrostatic Pressure，HHP）技术在食品工业中用于微生物灭活和食品保鲜，它能在低温下有效灭活病毒，同时最大程度减少热诱导变化。已有研究探索了 HHP 在疫苗生产中的应用，发现其可灭活病毒并保留关键抗原结构，具有开发有效疫苗的潜力。本研究旨在开发并验证基于 HHP 处理的疫苗生产方法，为全球疫苗开发提供新途径。

结果

1. 灭活评估：将含有病毒悬浮液的密封聚乙烯袋分别在 400MPa、500MPa 和 600MPa 下进行 HHP 处理 5 分钟。400MPa 处理使病毒感染性显著降低，但仍有部分病毒可复制；500MPa 和 600MPa 处理后未检测到感染性病毒，病毒复制被持续抑制，表明这两个压力可完全灭活病毒。
2. 负染色电子显微镜（nsEM）分析：400MPa 处理时，病毒整体形态保持完整；500MPa 处理后，病毒形态出现轻微改变，表面刺突排列变得不清晰或部分扭曲；600MPa 处理导致病毒形态严重破坏，表面刺突几乎消失，病毒粒子结构受损，出现不规则或塌陷形状，且形成许多聚集体。
3. 蛋白质印迹（Western blot）分析：对不同压力处理的病毒刺突蛋白进行 Western blot 分析，发现随着压力升高，单体（~140kDa）和三聚体（~450kDa）形式的刺突蛋白信号均减弱，同时高分子量（>450kDa）条带强度增加，可能是由于高压促使刺突蛋白或其他病毒成分聚集。与热灭活病毒相比，HHP 处理对刺突蛋白的破坏较小，热灭活病毒的刺突蛋白信号完全消失。
4. 体内免疫原性：B 细胞反应：在瑞士 CD1 小鼠中测试 HHP 灭活的 SARS-CoV-2 的免疫原性。所有免疫组在免疫 14 天后血清转化率均达 100%，抗体反应持续增强，在加强免疫后，HHP 灭活免疫组的抗体滴度在第 35 天达到峰值，而热灭活免疫组在第 53 天才达到峰值。500MPa HHP 处理组在各时间点的抗体滴度最高，引发的体液免疫反应最强。同时，HHP 处理组产生的抗体不仅针对 S 蛋白，还针对 N 蛋白，而热灭活组主要针对 N 蛋白，对 S 蛋白无明显抗体反应。
5. 体内免疫原性：T 细胞反应：在免疫第 53 天评估 T 细胞反应，500MPa 处理组在全血和脾脏样本中均显示出强大的 T 细胞反应，600MPa 处理组也有明显反应，但略逊于 500MPa 处理组。热灭活组的 T 细胞介导的免疫反应最弱，表明热灭活可能使病毒抗原变性或改变，降低了其免疫原性和刺激 T 细胞反应的能力。
6. 热稳定性评估：对 500MPa 灭活并纯化的疫苗制剂进行热稳定性评估，发现 4°C 储存时，疫苗在所有评估时间点均保持抗原稳定性，而室温储存仅在 14 天内稳定，30 天时抗原质量明显下降。这表明 HHP 灭活的疫苗在冷藏条件下可保持良好的抗原特性，减少对超低温冷冻的依赖。

讨论

新冠疫情期间疫苗分配的不平等凸显了全球公共卫生系统的问题，需要创新的疫苗生产和分配策略。HHP 技术在疫苗开发中具有诸多优势，包括保留抗原性、对不同病毒变体有效、热稳定性好、处理速度快以及成本效益高等。与传统热灭活方法相比，HHP 处理对病毒蛋白的破坏更小，能诱导更强大的体液和细胞免疫反应，500MPa 处理效果最佳。同时，HHP 灭活的疫苗在 4°C 下可稳定保存至少 30 天，降低了冷链运输和储存的成本与难度。此外，HHP 技术的物理作用机制使其受病毒遗传变异影响小，处理时间短，适合大规模生产，成本低，有助于提高疫苗的可及性，增强公众对疫苗的信任。然而，HHP 技术在疫苗生产中的应用仍面临挑战，需要进一步研究确定最佳的压力和处理时间参数，以实现对各种病毒的最佳灭活效果并保留抗原性。

尽管如此，HHP 技术在疫苗生产中的应用前景广阔，它为解决全球疫苗获取和分配问题提供了新的方向，有望缩小高收入和低收入国家之间的差距，确保更公平地获得救命的免疫接种。随着全球继续应对传染病和医疗保健不平等的双重负担，像 HHP 技术这样的创新方法对于构建更具包容性和弹性的全球卫生系统至关重要。

材料和方法

1. 细胞和病毒：使用 Vero E6 细胞培养，维持在含有多种补充剂的最低必需培养基（MEM）中。B.1 和 BQ.1.1 菌株从 SARS-CoV-2 阳性鼻咽拭子中分离，经测序和谱系分析后，在生物安全三级（BSL-3）设施中进行处理。这两种变体因刺突蛋白突变不同而被选择，用于评估 HHP 灭活对不同病毒株的效果。
2. HHP 处理制备灭活 SARS-CoV-2 及灭活评估：用第三代病毒株感染 Vero E6 细胞，收集上清液并进行 HHP 处理，在不同压力（400MPa、500MPa、600MPa）下处理 5 分钟，通过终点稀释滴定和在 Vero E6 细胞上培养评估病毒感染性降低和完全灭活情况，同时设置未处理的对照组。
3. 抗原纯化：通过超速离心和蔗糖垫纯化对病毒株进行浓缩和纯化，提高抗原纯度，用于后续实验。
4. 负染色电子显微镜（nsEM）：对 HHP 处理、未处理和热灭活的病毒样本进行 nsEM 分析，通过观察病毒形态结构的变化，了解 HHP 处理对病毒的影响。
5. 蛋白质印迹（Western blot）：提取病毒样本的总蛋白，进行 SDS-PAGE 电泳和转膜，用特定抗体检测病毒蛋白，分析不同处理对病毒蛋白的影响，以及免疫小鼠血清中抗体针对的病毒蛋白。
6. 体内免疫原性测试：在符合动物研究伦理准则的条件下，对瑞士 CD-1 小鼠进行体内免疫原性测试。将小鼠随机分为 7 组，分别接种不同处理的 SARS-CoV-2 抗原，包括 HHP 灭活（500MPa、600MPa）、热灭活以及 PBS 对照组，在不同时间点检测免疫反应。
7. 酶联免疫吸附测定（ELISA）：通过 ELISA 测定免疫小鼠血清中总抗 SARS-CoV-2 IgG 抗体，评估体液免疫反应的强度和变化。
8. 体液反应特异性表征：通过 Western blot 分析小鼠血清与病毒总蛋白的反应，确定 ELISA 检测到的抗体针对的具体病毒蛋白，了解免疫反应的特异性。
9. 病毒中和试验：评估免疫小鼠血清的中和活性，通过检测血清对病毒感染细胞的抑制能力，确定中和抗体滴度，反映免疫反应的有效性。
10. ELISpot 测定：免疫 53 天后，对循环外周血单核细胞（PBMC）和脾细胞进行 ELISpot 测定，评估 T 细胞对 SARS-CoV-2 刺激的反应，检测 IFNγ 分泌细胞的数量。
11. 热稳定性评估：将 HHP 灭活的病毒疫苗分别在室温（25°C）和冷藏温度（4°C）下储存不同时间，通过 Western blot 检测刺突蛋白的抗原性，评估疫苗的热稳定性。
12. 统计分析：使用 OriginPro 8.5 软件进行统计分析，根据数据分布情况选择合适的统计方法，包括单因素方差分析（ANOVA）、Tukey’s HSD 检验、Kruskal-Wallis 检验和 Dunn’s 事后检验，以评估实验结果的显著性。
13. 伦理声明：病毒株分离遵循赫尔辛基宣言准则，经机构审查委员会批准，并获得患者知情同意。动物实验符合国家法律规定，经伦理审查并获得授权。