iPSC 来源的肝细胞类器官：预测 AAV 基因治疗疗效的创新平台

本文研究了多种腺相关病毒（AAV）血清型在诱导多能干细胞（iPSC）来源的肝细胞类器官及肝癌细胞系中的转导效率和肝毒性。发现 AAV6 和 AAV8 在类器官中转导效率最高，且 AAV 在体外未诱导明显肝毒性，为预测 AAV 基因治疗疗效和安全性提供新平台。

　　

引言

重组腺相关病毒载体（rAAVs）已成为体内基因治疗的主要基因递送方法。目前，已有多种基于 AAV 载体的基因治疗产品获批上市，还有众多相关临床试验正在进行。肝脏因其在人体代谢等重要生理活动中的作用，成为 AAV 介导基因治疗的首批靶器官之一。

然而，在血友病 B 等疾病的研究中发现，临床前动物模型与人体对 AAV 介导基因治疗的反应存在显著差异。在动物模型中未出现的问题，如转基因产物的短暂表达和肝毒性，却在部分患者中出现。而且，AAV 介导的非肝脏靶向治疗也可能诱导肝毒性，不同物种对 AAV 的肝脏趋向性和转导效率存在差异。同时，由于物种间组织趋向性差异、T 细胞分化状态和功能、预先存在的免疫以及生物分布等因素的复杂相互作用，使得从临床前研究到人体应用的转化面临挑战。现有的体外肝脏 AAV 毒性测试系统也不可靠。因此，急需更好的模型来预测不同 AAV 对肝脏的转导以及安全性风险。本研究旨在评估多种 AAV 血清型在体外人肝模型中的转导效率和直接肝毒性，探索肝脏类器官作为预测 AAV 肝毒性平台的潜力。

结果

1. HepG2 和 HepaRG 细胞系可被多种 AAV 血清型转导：以 HepG2 和 HepaRG 细胞系作为人肝模型，用编码绿色荧光蛋白（GFP）的 AAV2、3、4、5、6、8 和 9，在感染复数（MOI）为 10⁶的条件下处理细胞，分析 GFP 表达情况。结果显示，处理后约 4 - 8 小时开始观察到 GFP 表达，不同 AAV 血清型在两种细胞系中的转导效率不同。HepG2 细胞中，AAV2 的转导效率最高；HepaRG 细胞中，AAV6 的转导效率最高。总体上，所有测试血清型在 HepaRG 细胞中的转导效率均超过 50%，而在 HepG2 细胞中，AAV8 和 AAV9 的转导效率较低。这表明 AAV 血清型和模型选择对研究 AAV 转导有重要影响。
2. iPSC 来源的肝细胞形成 3D 类器官：由于原代肝细胞难以被 AAV 转导，本研究使用 iPSC 来源的肝细胞构建体外模型。通过优化培养条件，将单细胞包埋在基质胶中，形成了多个类器官。在培养过程中，肝细胞逐渐形成相互连接并自我组织，第 7 天和第 14 天可明显观察到类器官。通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测肝细胞和干细胞相关基因的表达，发现随着培养时间增加，白蛋白（ALB）、α-1 - 抗胰蛋白酶（AAT；基因符号 SERPINA1）等肝细胞特异性基因表达逐渐增加，而胎儿肝细胞标记物甲胎蛋白（AFP）和富含亮氨酸重复序列的 G 蛋白偶联受体 6（LGR6）表达降低。免疫荧光染色也证实了培养 14 天后，关键肝细胞标记物 ALB、AAT 和去唾液酸糖蛋白受体 1（ASGR1）有明显表达，表明成功建立了 iPSC 来源的肝细胞类器官培养条件。
3. iPSC 来源的肝细胞类器官可被多种 AAV 血清型转导且存在供体差异：在两个供体来源的 iPSC 肝细胞类器官中，用不同 MOI（10⁴、10⁵和 10⁶）的 AAV8 和 AAV9 进行测试，发现 GFP 阳性类器官数量与 AAV 剂量相关，MOI 为 10⁶时阳性类器官百分比最高。用 AAV2、3、4、5、6、8 和 9（MOI 为 10⁶）处理类器官，分析 4 周内 GFP 表达情况。处理后第 2 天未检测到明显 GFP 信号，从第 14 天开始信号明显，表达在转导后约 7 天迅速达到平台期，并持续至第 28 天。不同供体间存在异质性，供体 3 的转导效率在所有测试血清型中约低 50%。不同血清型在不同供体中的转导效率也存在差异，但血清型转导效力的趋势在各供体中一致。AAV4 和 AAV5 的转导效率最低，AAV2、6、8 和 9 的转导效率最高。
4. AAVs 未诱导直接肝细胞损伤：用腺病毒或氯丙嗪处理 HepG2、HepaRG 细胞和四个类器官供体作为阳性对照，检测天冬氨酸转氨酶（AST）水平，发现处理后 AST 水平显著升高，表明这些模型可模拟直接肝毒性。而用 AAV2、AAV8 和 AAV9 处理细胞系和类器官培养物，在第 2 天 AST 水平未显著增加，说明在处理初期这些 AAV 血清型不会诱导 AST 相关的急性肝损伤。对类器官进行长达 28 天的 AST 释放评估，发现用多种 AAV 血清型处理后，AST 释放无显著升高。同时，通过检测细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平评估细胞活力，发现氯丙嗪处理后 HepG2 和 HepaRG 细胞的 ATP 水平大幅下降，而 AAV 处理后无显著下降，类器官处理 28 天后结果类似。这表明在该模型和时间范围内，所使用的 AAV 诱导直接肝毒性的风险较低。

讨论

尽管重组 AAV 载体取得了进展，但人们对其在人体内的精确生物分布、传播、毒性和转基因表达持续时间仍未完全了解，临床前研究与人体试验结果存在差异，影响患者疗效。本研究比较了 HepG2、HepaRG 细胞系和 iPSC 来源的肝细胞类器官对八种 AAV 血清型的转导效率。HepG2 细胞系成本低、易获取，但某些血清型在其中的转导效率不能完全反映临床情况；HepaRG 细胞系虽更昂贵，但对多种 AAV 血清型的转导效率较高，可能更能模拟临床转导结果。与原代肝球状体相比，iPSC 来源的肝细胞类器官更易被 AAV 转导，这可能与其更易接近的细胞结构有关。

AAV 转导效率受多种因素影响，其中 AAV 受体和共受体的表达水平是关键因素之一。不同模型中 AAV 转导效率的差异可能是由于这些受体表达不同，后续需进一步深入研究。此外，本研究的肝脏模型仅包含肝细胞，而肝脏由多种细胞类型组成，如枯否细胞、星状细胞和肝窦内皮细胞等，这些细胞可能影响 AAV 血清型的转导，且模型中未包含免疫效应细胞，可能限制了对 AAV 载体体内潜在肝毒性的预测能力。未来研究应构建更全面的肝脏模型，纳入多种细胞类型，以更好地理解 AAV 介导基因治疗中的相互作用和潜在毒性。

总之，本研究展示了重组 AAV 载体在多种肝细胞模型中的有效转导，但转导效率存在差异。研究强调了充分表征和评估体外模型转化性的重要性，选择合适模型对研究 AAV 转导效率和潜在治疗应用至关重要。

材料和方法

1. 细胞培养：HepG2 细胞在 37°C 解冻 3 分钟，转移至含 MEM 培养基（含 10% 胎牛血清）的离心管中，计数、离心后重悬，接种于胶原蛋白 I 型包被的培养瓶中培养两代。NoSpin HepaRG 细胞按制造商说明解冻，接种于 96 孔板，在特定时间更换培养基。
2. 培养 iPSC 来源的肝细胞类器官：本研究使用的人 iPSC 来源细胞购自 DefiniGEN，为匿名、去识别格式，无需伦理审查。将预分化的冷冻保存细胞解冻，接种于用基质胶包被的 96 孔板，添加含 ROCK 抑制剂的培养基，培养过程中定期更换培养基并添加基质胶。
3. 处理：AAV 构建体由 Virovek 提供，经两轮氯化铯超速离心纯化。HepG2 细胞在达到约 80% 汇合度时，接种于 96 孔板，6 小时后用含 AAV 和去铁胺（DFO）的鸡尾酒处理，通过成像观察转导情况 3 天。HepaRG 细胞培养 7 天后，用含 AAV 的培养基处理，成像观察 3 天。iPSC 来源的肝细胞类器官分化 14 天后，用含 AAV 的培养基处理，通过 Opera Phenix 高内涵筛选系统成像观察 28 天。转导效率通过计算 GFP 阳性细胞占总细胞数的百分比得出。同时，用氯丙嗪或腺病毒作为对照和肝毒性诱导剂处理细胞。
4. RT-qPCR：使用 RNeasy Micro Kit 提取总 RNA，用 QuantiTect Reverse Transcription Kit 将 RNA 转录为互补 DNA（cDNA）。在 QuantStudio 7 Flex 实时 PCR 系统上进行扩增，使用 TaqMan 基因表达分析试剂盒和 TaqMan Fast Advanced MasterMix。选用的引物包括 ALB、ASGR1、ASGR2、AFP、AAT 和 Lgr6 等相关基因，管家基因选用 PPIB 和 B2M。
5. 免疫荧光：对嵌入基质胶的类器官进行免疫荧光染色，依次进行洗涤、固定、通透化、封闭处理，然后与稀释的一抗在 4°C 孵育过夜。一抗包括抗白蛋白、抗 ASGR1 和抗 α1 - 抗胰蛋白酶抗体。次日，洗涤后与二抗 AF488 - 驴抗小鼠抗体孵育，再用 Hoechst 33342 染色，最后用 Opera Phenix 高内涵筛选系统成像。
6. 天冬氨酸转氨酶测量：用 Cobas pure c 303 分析仪分析培养上清液中的 AST 活性，测量范围为 5 - 700 U/L。
7. 三磷酸腺苷测量：使用 CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒检测 ATP 含量，按制造商说明操作。
8. 图像分析：用 Incucyte 活细胞分析系统、Harmony 高内涵成像和分析软件以及 ImageJ.JS 对 GFP 标记的 AAV 转导后的图像进行分析，分别计数 GFP 阳性类器官和总类器官的数量。

数据可用性

支持本研究关键发现的数据可在文章和补充材料中获取，也可向通讯作者 Estelle Berreur 索取。

致谢

本研究由罗氏制药研发资助，图形摘要由 BioRender 制作。

作者贡献

E.B.、G.L.、C.R. 和 R.M. 设计实验；E.B.、G.L. 和 C.R. 建立模型；E.B. 进行实验；M.Z. 和 M.S. 进行 AST 测量；E.B. 分析数据、制作图表并撰写手稿；R.X.、E.B.-N.、R.M. 和 A.B.R. 审阅手稿。

利益声明

所有作者均为霍夫曼 - 罗氏公司员工。公司以工资形式为作者提供支持，但在研究设计、数据收集与分析、出版决策或手稿准备方面无其他额外作用。在撰写本文过程中，作者使用了 RocheChat 优化句子结构和语言，之后对内容进行了审查和编辑，并对出版物内容承担全部责任。

补充信息

提供了两个补充文档，Document S1 包含图 S1 和表 S1，Document S2 包含文章及补充信息，可从指定链接下载。