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本文聚焦神经元热休克反应，发现神经元受热冲击时会关闭全局翻译、减缓核糖体速度并抑制综合应激反应（ISR）。恢复过程中，翻译恢复且 ISR 短暂激活。研究揭示了相关调控机制，为理解神经元热休克反应及相关疾病提供新视角，值得关注。
研究背景
在哺乳动物中枢神经系统（CNS）中，大脑温度通常维持在 36.9°C ± 0.4°C ，在一些生理活动时会有 ±2°C - 3°C 的波动。然而，极端的 CNS 挑战，如药物滥用、中风、创伤性脑损伤（TBI）、中暑等，会使大脑温度升高超过 3°C，这与较差的预后相关，包括死亡率增加和 CNS 恢复能力下降。
自 1962 年热休克反应被发现以来，人们了解到细胞在热休克时会上调热休克蛋白（HSP）并下调全局蛋白质合成。HSP 的上调对细胞健康和生存至关重要，其中 Hsp70 家族尤为重要。但在小鼠、大鼠和兔子模型中，神经元在热休克或基线时 Hsp70 蛋白难以检测到。同时，热休克介导的蛋白质合成下调机制尚不完全清楚，虽然已有研究涉及真核起始因子 2 - α（p - eIF2α）磷酸化，但抑制 p - eIF2α 并不能阻止热休克诱导的蛋白质合成下调。鉴于神经元能在高于自然变化的温度下存活且缺乏典型的 Hsp70 表达，本研究旨在探究神经元通过翻译调控适应热休克的机制。
研究方法
- 细胞培养：使用野生型 C57BL/6NCrl 小鼠胚胎制备原代神经元培养物，同时培养 HEK293 和 HeLa 细胞系，用于后续实验。
- 热休克实验：将原代神经元细胞在 37°C 培养 2 小时使其贴壁后，转移至 42°C 进行热休克处理，设置不同时间点，部分实验在热休克后再转移回 37°C 进行恢复培养。使用蓝牙温度探针监测温度，精确控制实验时间。
- 蛋白质合成检测：采用35S - 蛋氨酸 / 半胱氨酸放射性标记和嘌呤霉素（puromycin）掺入实验，检测神经元在热休克及恢复过程中的蛋白质合成情况。
- 多聚核糖体分析：对神经元进行多聚核糖体分析，研究热休克对核糖体分布的影响，包括制备细胞裂解物、进行蔗糖梯度超速离心等步骤。
- RNA 测序（RNA - seq）和核糖体分析：收集样本进行 RNA - seq 和核糖体分析，以研究热休克过程中基因表达和核糖体与转录本的关联变化。对数据进行一系列处理和分析，如使用特定软件进行序列比对、定量等。
- 药物处理实验：使用放线菌素 D（ActD）抑制转录，冈田酸（okadaic acid）抑制 PP2A 磷酸酶，eEF2 激酶抑制剂（eEF2Ki; A - 484954）抑制 eEF2 磷酸化等，观察这些药物对神经元热休克反应的影响。
研究结果
- 热休克神经元下调全局翻译并抑制综合应激反应
- 神经元在 42°C 热休克时，Hsp70 蛋白无明显表达，同时全局蛋白质合成下降，且这种下降不是由蛋白质降解引起。神经元必须在热休克 1 小时内恢复到 37°C 才能恢复蛋白质合成并存活。
- 热休克时 p - eIF2α 水平略有升高，但与已知的 ISR 诱导化合物相比，热休克神经元中 ATF4 的翻译水平极低，表明热休克抑制了 ISR 介导的 ATF4 翻译。ISR 抑制剂（ISRIB）在热休克期间无法恢复全局蛋白质合成。
- 热休克神经元的核糖体延长缓慢且在恢复时准备翻译
- 通过哈林通碱（HT）核糖体释放实验发现，热休克 15 分钟的神经元核糖体在 HT 处理后的 M/P 比值与对照组不同，且热休克时蛋白质合成速率降低，表明核糖体延长缓慢。
- RNA - seq 和核糖体分析结果显示，热休克 15 分钟时，核糖体与现有转录本的关联变化不大，全局转录变化也较小；60 分钟时，核糖体与现有和新合成转录本的关联发生显著变化，主要涉及蛋白质折叠途径，但翻译效率无明显变化。对特定转录本（如 GAPDH 和 Hspa1a）的研究发现，热休克期间它们与核糖体的结合发生改变，且在恢复过程中逐渐恢复到对照水平。
- 用 ActD 处理神经元的实验表明，热休克期间部分转录本会加载核糖体并在恢复时准备表达，如 Hspa1a 转录本在热休克时加载核糖体，但 Hsp70 蛋白在恢复时才检测到。
- 真核延伸因子 2 的磷酸化调节神经元热休克反应和翻译恢复
- 热休克时 eEF2 发生磷酸化，恢复时 p - eEF2 去磷酸化，这与蛋白质合成的恢复相关。抑制 PP2A 磷酸酶会阻止 p - eEF2 去磷酸化，从而抑制蛋白质合成的恢复。
- 用 eEF2Ki 抑制 eEF2 磷酸化，虽不能完全恢复热休克样本的全局蛋白质合成，但能部分恢复 cap - independent ATF4 的表达。在恢复过程中，ISRIB 处理能更快速地恢复全局蛋白质合成。
- 与神经元相比，HeLa 细胞对热休克表现出相似但不同的翻译反应
- HeLa 细胞在热休克 0 - 60 分钟内，p - eEF2 和 p - eIF2α 的变化与神经元相似，但超过 60 分钟后，HeLa 细胞表现出经典的 ISR，涉及 eIF2α 磷酸化和 ATF4 表达的负反馈调节。
- HeLa 细胞在热休克 8 小时后仍能存活并在 24 小时恢复翻译，而神经元在热休克 60 分钟后则无法存活。HeLa 细胞经 eEF2Ki 处理后，在热休克和恢复过程中也表现出 p - eEF2 抑制和 ATF4 蛋白表达增加的现象。
研究讨论
- 热休克反应机制：本研究表明，神经元在轻度热休克时，翻译减少是由于核糖体速度减慢、新转录的时间协调以及核糖体与转录本的关联变化。热休克期间，ISR 介导的 ATF4 翻译受到抑制，而在恢复阶段，ISR 短暂激活，使神经元对 ISRIB 产生反应。eEF2 的磷酸化在减缓核糖体速度和抑制 ISR 方面起到一定作用，不过其他因素也可能影响延伸速度。
- ISR 的作用及相关药物：ISR 可由多种应激源诱导，在维持细胞内稳态中起重要作用。ISRIB 作为 ISR 抑制剂，在热休克神经元恢复阶段使用可促进神经元存活，减少细胞死亡标记物 caspase - 3 的切割。
- 热休克相关转录本及蛋白：研究鉴定出神经元热应激诱导的新转录本，如 Hspb1、Hsph1 和 Hspa1a 等，这些转录本在恢复时会被翻译。其中，Hsp70 蛋白的表达在神经元中受到严格调控，其过表达在不同情况下对神经元功能有不同影响。
- 不同细胞类型的比较：虽然神经元在热休克时缺乏典型的 Hsp70 蛋白表达，但在 HeLa 细胞中也观察到类似的翻译控制机制，这表明热应激诱导的翻译下调机制可能在不同细胞类型中具有一定的保守性。
研究局限性
本研究使用急性给药的药理学抑制剂研究分子途径，可能存在抑制不完全的问题。由于敲除相关基因可能引入发育偏差和补偿机制，未使用基因敲除模型。此外，本研究在原代小鼠神经元中进行，无法直接推断这些结果对大脑功能的影响，未来体内研究可基于本研究成果进一步开展。
