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在免疫疗法和疫苗临床试验中，EliSpot 和 FluoroSpot 检测缺乏正式验证指导。研究人员开展 IFN-γ/IL-2 双色 FluoroSpot 检测的验证研究，确定了验证参数等，证明该检测适用于可靠检测抗原特异性免疫反应，有助于推动相关领域发展。
在医学研究和临床实践中，免疫监测是评估免疫疗法和疫苗效果的关键环节。酶联免疫斑点（EliSpot）检测及其荧光版本 FluoroSpot 检测，凭借高灵敏度，能在单细胞水平检测和量化免疫细胞激活，常用于监测抗原特异性 T 和 B 细胞反应，在癌症治疗和传染病预防的疫苗研究中意义重大。然而，由于缺乏正式的行业指导，这两种检测在验证、设置验收标准及确保准确性能方面面临诸多挑战，影响了临床研究结果的可靠性，也阻碍了相关领域的进一步发展。
为了解决这些问题，德国 Genome Identification Diagnostics GmbH 的研究人员 Alexandra Mauthe、Edward Cedrone 等人开展了深入研究。他们通过全面的体外实验，利用健康人类供体的外周血单个核细胞（PBMCs）和模型抗原，对一种用于监测抗原特异性淋巴细胞的双色 FluoroSpot 检测进行验证，并进行了实验室间比对。研究结果表明，该 IFN-γ/IL-2 FluoroSpot 检测适用于可靠检测 PBMC 样本中的抗原特异性免疫反应，符合当前生物分析方法验证的监管要求，不同实验室间的检测结果具有一致性。这一成果发表在《The AAPS Journal》上，为免疫监测领域带来了新的突破，为后续的临床研究和治疗提供了更可靠的技术支持。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，从当地血样采集机构获取血样，通过 Ficoll 密度梯度离心法分离出 PBMCs，并进行预筛选和冻存。实验时，将 PBMCs 复苏、培养后用于 FluoroSpot 检测。在检测过程中，使用特定的试剂盒和抗原肽混合物刺激细胞，然后通过添加荧光标记抗体，利用 AID iSpot Spectrum reader 和 AID multiSpot reader 读取和分析数据。同时，按照欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）的建议及相关文献确定验证参数和验收标准，进行实验室间比对研究。
研究结果主要从以下几个方面展开：
- 测定检测限：通过评估背景信号确定检测限（LOD），LOD 定义为检测能检测到的最低反应水平，高于此水平样本被视为对特定刺激有反应。IFN-γ、IL-2 和 IFN-γ + IL-2 的 LOD 分别为 4、18 和 2 个斑点 / 孔。分析模拟对照孔的背景信号时，IFN-γ 和 IFN-γ + IL-2 的 LOD 不变，IL-2 的 LOD 略低为 17 个斑点 / 孔1。
- 确定最小阳性对照反应：评估阳性对照以确定供体 PBMCs 的功能，计算最小阳性对照反应。IFN-γ 的最小阳性对照反应为 430 个斑点 / 孔，由于 IL-2 的 87 个阳性对照样本结果为 “无法计数（TNTC）”，无法确定 IL-2 和 IFN-γ + IL-2 的最小阳性对照反应2。
- 计算定量下限：评估抗原特异性反应以确定定量下限（LLOQ），LLOQ 定义为高于 LOD 且在 77.8% 的实验中，三个重复孔的内部变异系数（% CV）≤30.0 的最低平均供体反应。在 CEF 刺激样本中，IFN-γ、IL-2 和 IFN-γ + IL-2 的 LLOQ 分别为 32、27 和 21 个斑点 / 孔；SARS-CoV-2 刺激样本中，相应的 LLOQ 分别为 20、27 和 19 个斑点 / 孔3。
- 计算定量上限：评估阳性对照确定定量上限（ULOQ），ULOQ 定义为在 77.8% 的实验中，三个重复孔的 % CV≤30.0 的最高平均供体反应。IFN-γ 的 ULOQ 为 821 个斑点 / 孔，由于 IL-2 多数样本结果为 TNTC，未确定 IL-2 的 ULOQ4。
- 评估检测性能：
- 批内精密度：分析同一测试板上来自十个供体的 PBMCs 的六个重复样本评估批内精密度，计算重复样本均值的 % CV。CEF 刺激孔中，IFN-γ、IL-2 和 IFN-γ + IL-2 的平均 % CV 分别为 5.7、8.9 和 8.1；SARS-CoV-2 刺激孔中，相应的平均 % CV 分别为 8.6、10.1 和 8.3。所有抗原反应≥LLOQ 的样本批内 % CV 均≤15.0，符合预定义验收标准5。
- 批间精密度：在不同日期由四个操作人员进行九次实验，分析来自十个供体的 PBMCs 评估批间精密度。CEF 刺激孔中，IFN-γ、IL-2 和 IFN-γ + IL-2 的平均 % CV 分别为 16.2、24.5 和 25.3；SARS-CoV-2 刺激孔中，相应的平均 % CV 分别为 15.0、17.6 和 24.1。86.1% 的抗原反应≥LLOQ 的样本批间 % CV≤30.0，符合验收标准6。
- 线性：通过接种不同细胞密度评估检测线性，线性范围定义为线性回归相关系数 R2≥0.9 的细胞密度范围。在评估 5×10?至 3×10?个细胞 / 孔时，18 个抗原反应中有 12 个 R2≥0.9；评估 5×10?至 2×10?个细胞 / 孔时，18 个抗原反应的 R2 均≥0.9，平均为 0.9817。
- 特异性：所有阳性对照的斑点数均大于阴性和模拟对照。IFN-γ 的阴性和模拟对照平均斑点数为 2.5 个 / 孔，阳性对照为 661.7 个 / 孔；IL-2 的阴性对照平均斑点数为 9.9 个 / 孔，模拟对照为 9.3 个 / 孔，多数阳性对照为 TNTC；双阳性斑点的阴性和模拟对照平均斑点数分别为 0.7 和 0.6 个 / 孔8。
- 稳健性：评估不同平板干燥时间、刺激时间和每孔细胞数对检测的影响。在抗原反应≥LLOQ 的情况下，平板干燥时间的 13 个样本、每孔细胞数的 10 个样本和刺激时间的 13 个样本的 % CV 均≤30.0，证明检测具有稳健性9。
- 实验室间比对：两个实验室的检测性能在绝对斑点计数、检测控制性能、斑点计数类别和反应性方面具有一致性。虽然 IL-2 在确定斑点计数类别和反应性时一致性略有下降，但整体结果表明该检测适用于不同实验室对 PBMC 样本的标准化生物分析1011。
研究结论表明，IFN-γ/IL-2 双色 FluoroSpot 检测在免疫监测中具有重要价值。它能够可靠地检测 PBMC 样本中的抗原特异性免疫反应，满足当前生物分析检测和方法验证的监管要求。与传统 ELISA 相比，该检测不仅能定量检测激活细胞，还能对表达两种细胞因子的细胞进行定量，更准确地提供机制见解。同时，FluoroSpot 检测可实时捕获细胞产生的细胞因子，克服了 ELISA 在分析前离心步骤中细胞因子不稳定和清除的局限性。然而，研究也指出，在应用该检测时，需确保 PBMC 的采集和冷冻保存程序标准化，且其他细胞因子组合的 FluoroSpot 检测需参考本研究进行部分验证。此外，在确定样本反应性时，应考虑样本背景反应性对 LOD 计算的影响，可采用中位数计算 LOD 或仅关注刺激指数（SI）等方法来优化判断标准。总体而言，该研究为疫苗和免疫疗法的临床开发和监测提供了一种定量、高灵敏度且经济有效的分析激活淋巴细胞的方法，推动了免疫监测领域的发展，为未来相关临床研究和治疗决策提供了有力的技术支持 。
