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在真菌基因工程中，构建和优化新细胞工厂面临诸多难题，CRISPR 技术虽有潜力但未充分利用。研究人员开展黑曲霉 CRISPR-Cas12a/Cpf1 多重基因编辑研究，成功构建能表达多个 gRNA 的质粒，实现多基因同时删除，加速细胞工厂建设。
在工业生物技术领域，曲霉属真菌一直发挥着重要作用。早在一个多世纪前，它们就被用于食品发酵，像味噌、酱油和清酒的制作，还用于柠檬酸生产以及淀粉酶等天然酶的制造。随着时间的推移，其应用范围不断拓展，开始用于生产其他有机酸和具有商业价值的异源蛋白 。
然而，构建和优化新的细胞工厂并非易事。这不仅需要整合生产产品所需的基因，还得对菌株进行大量特定的基因改造，以此提高产品的产量、稳定性、纯度和安全性。可这个过程往往极为漫长，通常需要好几年时间。因此，开发更高效的真菌基因工程方法迫在眉睫。
CRISPR 技术的出现，给真菌基因工程带来了新的希望。它极大地提高了基因靶向实验的效率，甚至能实现无标记修饰。但目前，绝大多数真菌 CRISPR 实验采用的是迭代式的逐步工程流程，也就是多次进行单基因靶向操作，这使得细胞工厂的构建周期很长。虽然 CRISPR 多重编辑技术有望解决这一问题，可在真菌领域的应用还处于起步阶段。其中的关键挑战在于，如何同时将多个引导 RNA（gRNA）递送至目标位点，让 CRISPR 核酸酶在基因组的相关靶点处引入 DNA 双链断裂（DSBs） 。并且，CRISPR 编辑的效果取决于单个 gRNA 的效率，如果有一个或多个 gRNA 无法有效介导 DSBs，多重编辑就会受到严重阻碍。在单基因编辑实验中，要想实现可靠的编辑，就得先鉴定出高效的 gRNA，可这一过程既繁琐又耗时，大大削弱了多重编辑原本能节省的时间优势。
为了解决这些难题，丹麦技术大学（Technical University of Denmark）和 Better Dairy Ltd 的研究人员展开了深入研究。他们致力于开发一种高效的系统，用于构建 CRISPR-Cpf1 载体，实现黑曲霉（Aspergillus Niger）的多重基因组编辑，从而加速细胞工厂的建设进程。最终，他们成功建立了这样一个系统，相关研究成果发表在《Fungal Biology and Biotechnology》上。这一成果意义重大，为真菌基因工程领域带来了新的突破，有望显著缩短细胞工厂的构建时间，提高生产效率。
研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是 USER 克隆技术，用于构建包含多个 gRNA 表达盒的质粒。通过这种技术，能将多个 gRNA 有序地组装到载体中。其次是利用黑曲霉 NIG159 菌株进行实验，该菌株为非同源末端连接（NHEJ）缺陷型，这一特性有助于在实验中观察基因编辑的效果。另外，还使用了诊断 PCR 技术来筛选和鉴定转化子，确定基因编辑是否成功。
基于 Cpf1 的真菌多重基因编辑方法
研究人员开发的系统基于一组质粒，每个质粒都带有不同的真菌标记（如 pyrG、argB、hph 和 ble），这些质粒之前被用于通过单个 gRNA 进行 Cpf1 介导的真菌基因编辑。质粒中含有 AMA1 序列，用于在真菌中复制；还有经过密码子优化和核定位信号（NLS）扩展的 Lachnospiraceae bacterium cpf1 基因，用于产生 Cpf1 蛋白；以及尿嘧啶特异性切除试剂（USER）克隆盒，方便通过大肠杆菌进行 USER 融合，插入 gRNA 表达盒 。
最初，这些载体用于递送单个 gRNA，gRNA 通过 tRNA 加工机制从前体 RNA 中释放出来。在本研究中，研究人员设计了新策略，让 gRNA 阵列表达九到十个引导 RNA 作为单个前体 RNA 分子，并在其两侧加上 tRNA 序列。转录后，细胞中的 RNase Z 和 tRNase P 会去除两侧的 tRNA 序列，而 Cpf1 则会在 gRNA 茎环上游切割，释放出成熟的 gRNA 。
为了将多个 gRNA 组装到表达盒中，研究人员设计了 USER 兼容的 PCR 片段，使其带有与 gRNA 阵列中第一个或最后一个 gRNA 互补的突出端。然后，使用一系列双链 DNA 寡核苷酸（bio-blocks），通过互补的单链突出端，将 gRNA 序列组装到表达盒中。通过这种方式，成功构建了能递送多个 gRNA 的质粒。
多 gRNA 表达盒的构建
为了探究该方法的效率，研究人员进行了三次多重实验。每次实验都旨在使用单个 CRISPR 载体，同时删除黑曲霉中三个不同基因起始密码子附近约 300bp 的片段。实验中，每个基因使用三个 gRNA，所以每个 CRISPR 载体表达的前体 RNA 包含九个 gRNA 。
研究人员针对三组不同的基因进行突变实验，分别命名为基因集 1（基因 A、B 和 C）、基因集 2（基因 D、E 和 F）和基因集 3（基因 G、H 和 I）。他们使用 pAC1430（pyrG）和 pAC1749（hph）作为 CRISPR 载体的骨干，通过一步 USER 融合，将线性化的载体骨干、两个 USER 兼容的 PCR 片段和五个 gRNA bio-blocks 有序融合，构建出了相应的 CRISPR 载体（pCpf1.MEC1、pCpf1.MEC2 和 pCpf1.MEC3） 。
此外，为了探索系统的上限，他们还构建了一个载体（pCpf1.MEC4），旨在通过每个靶基因仅表达两个 gRNA，诱导另外五个基因（基因 J、K、L、M 和 N）形成 DNA DSB 。通过筛选大肠杆菌转化子并进行 Sanger 测序，研究人员成功鉴定出了正确构建的质粒，这表明该 USER 克隆方法在构建多基因靶向的 CRISPR-Cpf1 质粒方面非常有效。
黑曲霉中的多重基因缺失
为了在 Cpf1 切割后实现准确的基因缺失，研究人员使用了基因靶向底物（GTSs），它由计划删除区域上下游的 500bp 侧翼序列融合而成 。他们将黑曲霉 NIG159 原生质体与三个 CRISPR 质粒（pCpf1.MEC1、pCpf1.MEC2 和 pCpf1.MEC3）分别进行共转化，并同时加入相应的 GTSs，每组实验重复三次。作为对照，他们还进行了不添加 GTSs 的 CRISPR 质粒转化实验。
由于 NIG159 是 NHEJ 缺陷型菌株，在没有修复模板（即 GTSs）的情况下，DSBs 会导致细胞死亡。实验结果正如预期，对照组没有生长，这表明每个前体 gRNA 都至少释放出了一个功能性 gRNA 。
在添加 GTSs 的转化实验中，每个基因集都产生了 6 - 33 个外观健康的菌落。研究人员随机选择了一些转化子，通过诊断 PCR 进行基因分型。结果显示，使用 pCpf1.MEC1 共转化的实验中，21 个筛选的转化子中有 17 个可能是同核体，并且包含所有三个基因的缺失；使用 pCpf1.MEC2 的实验中，21 个转化子中有 8 个包含所有三个基因的缺失；使用 pCpf1.MEC3 的实验中，鉴定出 6 个包含所有三个基因缺失的转化子 。这些实验表明，通过使用三个未经验证的 gRNA 靶向每个靶基因，利用 CRISPR-Cpf1 诱导的同源重组（HR），可以稳定地引入三个特定的基因组修饰 。
对于表达十个 gRNA 的 CRISPR 质粒 pCpf1.MEC4 的共转化实验，效率较低，三次独立试验仅获得六个健康的转化子。但和其他质粒实验一样，不添加 GTSs 会进一步降低细胞活力，这表明至少释放出了一个功能性 gRNA 。对这六个转化子进行诊断 PCR 检测后发现，它们都是同核体，其中三个包含三个基因的缺失，两个包含两个基因的缺失，一个包含一个基因的缺失，虽然没有出现所有基因都缺失的转化子，但覆盖了四个基因，说明该系统有可能产生四重缺失突变 。
研究结论和讨论部分指出，本研究建立了一种基于 AMA1 载体的高效黑曲霉 Cpf1 多重 CRISPR 编辑策略。该策略利用 Cpf1 的 RNase 活性和 tRNA 加工机制，从单个前体 RNA 中释放多个 gRNA，能够在至少三个位点同时进行无标记的靶向缺失，而且无需对功能性 gRNA 进行冗长的预先验证，大大加速了复杂菌株的构建工作。
不过，研究也发现，随着靶向基因数量的增加，形成非预期修复产物的可能性可能会上升，转化子的活力会降低，这可能是因为细胞受到的压力增大，导致更多地使用替代修复途径，如微同源介导的末端连接（MMEJ） 。并且，构建包含许多 gRNA 的表达盒在大规模实验中可能会成为障碍。
为了进一步优化该技术，研究人员提出了一些改进方向。比如，可以采用体内 DNA 组装技术构建载体，完全省略细菌克隆步骤，提高菌株工程的速度；使用包含多个完整 gRNA 的更大 bio-blocks，同时缩短 gRNA 靶向序列的长度，以减轻构建表达盒的困难；利用新型 DNA 合成技术，如末端脱氧核苷酸转移酶介导的合成，帮助组装更复杂的 gRNA 阵列；通过 gRNA 衰减降低 Cpf1 诱导 DSBs 的速率，减轻细胞 HR 机制的负担，提高转化效率；还可以通过添加 HR 诱导分子、增强 HR 机制或引入更高效的异源系统等方式，扩展 HR 能力 。此外，如果单个实验中可有效修复的 DSBs 数量存在上限，还可以探索使用催化改变的 Cpf1 碱基编辑器进行 DSB 非依赖的 CRISPR 编辑，虽然这种方法不能实现大规模缺失，但可以引入点突变使基因失活，在需要同时改变多个蛋白质功能时可能会很有用 。
总的来说，这项研究为真菌基因工程提供了一种高效的多重基因编辑方法，为加速细胞工厂的构建奠定了坚实基础，有望在工业生物技术领域带来广泛的应用和变革。
