建立葡萄原生质体高效分离与转化体系：为基因编辑应用奠定基础

本研究针对葡萄(Vitis vinifera L.cv. Chardonnay)原生质体(protoplast)分离和再生难题，通过优化叶片预处理、酶解时间和PEG介导转化条件，建立了高效稳定的原生质体体系（产量7.5×106/g，存活率91%，转化效率87%），并首次实现微愈伤组织诱导。该成果为葡萄基因功能分析、CRISPR/Cas9试剂验证及无转基因基因组编辑提供了关键技术平台。

　　

气候变化正对葡萄栽培这一高价值农业领域构成严峻挑战，包括温度、水分和病原体等多重胁迫。传统育种因耗时耗力且可能破坏克隆遗传完整性，促使科学家转向基因组编辑技术。然而，葡萄作为木本植物的组织培养和再生存在显著基因型依赖性，而原生质体（去除细胞壁的植物细胞）因其可直接用于CRISPR试剂验证和再生无嵌合体植株的优势，成为突破瓶颈的关键。但现有葡萄原生质体体系存在产量低、转化效率不稳定、再生困难等问题，特别是广泛栽培的Chardonnay品种缺乏优化方案。

Manisa Celal Bayar University的研究团队通过系统优化叶片年龄、切割方式、酶解时间等参数，建立了Chardonnay叶肉原生质体的高效分离体系。研究采用PEG-Ca²⁺介导的转化方法，以含GFP基因的pMOD_C3001载体验证效率，并通过固体/液体MS培养基（含2 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L BA）评估再生潜力。关键技术包括：FDA染色检测活力、蔗糖梯度纯化、荧光显微镜观察GFP表达，以及PCR验证转基因整合。

原生质体高效分离体系的建立
研究发现20 mg幼叶（第1-2叶位）在8小时酶解（1.5% cellulase R10+0.75% macerozyme R10）时产量最高（75×10⁶/g），显著优于成熟叶片。条带切割法（0.5-1.0 mm）较随机切割或胶带剥离法更有效，且避免甘露醇预处理可提升产量75%。70 μm滤网过滤结合离心纯化（非冰浴或蔗糖梯度）能最大限度保留完整原生质体，FDA检测显示初始存活率达91%。

PEG转化条件的精准优化
5×10⁵个原生质体与15 μg质粒DNA在40% PEG-4000中孵育5分钟时转化效率达峰值87%，远超文献报道的同类品种数据。W5缓冲液后处理结合16小时暗培养可维持GFP稳定表达，PCR证实473 bp靶片段成功整合。

再生障碍与微愈伤组织突破
尽管在含2,4-D/BA的MS培养基中成功诱导出微愈伤组织（120天形成肉眼可见团块），但未观察到根芽分化。Lloyd培养基中添加TDZ/NAA可促进愈伤增殖，但胚胎发生仍受限，印证叶肉来源原生质体再生存在组织特异性障碍。

该研究首次为Chardonnay建立了标准化原生质体实验流程，其高转化效率（87%）为快速验证sgRNA/Cas9组合提供了可靠平台。虽然再生完整植株仍需进一步优化，但微愈伤组织的形成标志着技术突破。成果发表于《Protoplasma》，为葡萄抗逆基因编辑、启动子活性分析等研究奠定方法学基础，尤其对气候适应性品种改良具有重要实践意义。