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疟疾严重威胁人类健康，现有防控策略因耐药问题受阻。研究人员开展基于 CRISPR 归巢机制的疟原虫基因功能研究。结果发现 PBANKA_0916000 编码的 CRTL 蛋白对卵囊发育至关重要。该研究为阻断疟疾传播提供新靶点和研究方法。
疟疾，这一由疟原虫引发、经雌性按蚊传播的传染病，长期以来严重威胁着人类的健康，尤其是 5 岁以下儿童。曾经，通过使用长效驱虫蚊帐和室内残留喷洒等媒介控制策略，在 2000 年至 2015 年间成功避免了 68% 的疟疾病例。但令人头疼的是，杀虫剂抗性蚊子和耐药性疟原虫的出现，让这一积极趋势发生逆转，截至 2022 年，疟疾导致的死亡人数已达 60.8 万。面对如此严峻的形势，深入了解疟疾传播的生物学机制，寻找新的防控策略迫在眉睫。
在此背景下，瑞典于默奥大学（Ume? University）的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们致力于解决在疟原虫蚊子阶段，由于受精形成二倍体细胞，阻碍了对其基因功能研究的难题。研究人员开发了一种可扩展的遗传系统，利用带有条形码的基因靶向载体和 CRISPR 介导的归巢机制，成功在合子中引入修饰等位基因后，产生纯合功能缺失突变体。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为疟疾防控研究开辟了新方向。
在研究方法上，研究人员主要运用了以下关键技术：一是构建单性别疟原虫系，通过破坏特定基因（fd1 或 md4）来获得只产生雄性或雌性配子体的疟原虫系；二是设计颜色交换实验，以此来定量评估受精后 Cas9 介导的基因组编辑效率；三是进行基于 CRISPR 归巢的筛选实验，将 gRNA 表达盒插入 21 个基因敲除载体，通过转染、感染蚊子等一系列操作，分析条形码丰度来寻找新的基因功能。
下面来看具体的研究结果：
- 单性别 P. berghei 系表达荧光蛋白标记的 Cas9 具有生育能力：研究人员通过破坏 fd1 或 md4 基因，创建了只产生雄性或雌性配子体的单性别疟原虫系，并在这些系中表达 Cas9 - BFP 融合蛋白。实验发现，这些单性别系在单独传播时不产生卵囊，但共同感染小鼠后可恢复卵囊形成，不过 Cas9 的表达可能会对卵囊数量产生一定影响。
- Cas9 介导的受精后基因组编辑效率高：设计颜色交换实验，构建分别表达 MyoA - mCherry 和 MyoA - GFP 的互补单性别系。实验结果表明，当 gRNA 由雌配子表达时，归巢效率可达 97%；由雄配子携带时，效率降至 89%。这证明了研究人员开发的 CRISPR 方法可使卵囊表型主要由一个亲本等位基因决定。
- 归巢可扩展用于筛选新的受精后表型：将 gRNA 表达盒插入 21 个基因敲除载体，进行筛选实验。结果发现，该筛选揭示了一些基因在卵囊发育中的新功能，如转录因子 ap2 - o4 的 gRNA 导致卵囊条形码显著减少，同时也发现了两个未知功能基因 PBANKA_0916000 和 PBANKA_1006400 的明显归巢效应。
- PBANKA_0916000 编码一种与氯喹抗性转运蛋白相关的重要消化液泡蛋白：对 PBANKA_0916000 进行深入研究，发现其编码的氯喹抗性转运蛋白样（CRTL）蛋白定位于卵囊的消化液泡。CRTL 基因敲除的卵囊生长受阻，无法产生唾液腺子孢子，表明该基因对疟疾传播至关重要。结构建模显示，PbCRTL 与 PfCRT 结构相似，但底物特异性可能不同。
研究结论和讨论部分指出，基于 gRNA 的归巢系统使疟原虫蚊子阶段的遗传筛选成为可能，克服了以往的研究障碍。虽然该技术存在一些局限性，如部分基因由于 gRNA 效率、母体遗传等因素无法在筛选中显示表型，但总体而言，该研究揭示了 CRTL 在卵囊发育中的重要作用，为理解疟原虫卵囊的生物学机制提供了新视角。同时，这种可扩展的新筛选策略有助于系统发现疟疾传播的关键基因，为评估其作为阻断传播干预靶点的潜力提供了可能，为疟疾防控研究带来了新的希望和方向 。
