揭秘 JINR1 调控 miR-216b-5p/GRP78 和 miR-1-3p/DDX5 轴促进病毒感染与细胞死亡的机制

本文聚焦于日本脑炎病毒（JEV）和西尼罗河病毒（WNV）感染。研究发现 lncRNA JINR1 通过调控 miR-216b-5p/GRP78 和 miR-1-3p/DDX5 轴，促进病毒感染和神经元细胞死亡，为开发抗 JEV/WNV 感染的药物提供潜在靶点。

　　

研究背景

日本脑炎病毒（JEV）和西尼罗河病毒（WNV）属于黄病毒科正黄病毒属，是单链 RNA 病毒，可感染中枢神经系统（CNS），导致神经元细胞死亡和炎症。目前针对 JEV 的疫苗接种不广泛，WNV 尚无获批疫苗，也缺乏临床认可的抗病毒药物，因此深入了解病毒生物学和开发应对策略至关重要。

长链非编码 RNA（lncRNA）长度超 200 核苷酸（近期定义超 500 核苷酸），可通过 RNA - RNA、RNA - DNA 和 RNA - 蛋白质相互作用调节基因表达，参与多种细胞功能调控，在病毒感染中也发挥重要作用。已有研究表明，多种 lncRNA 在不同病毒感染时表达差异，但在 JEV/WNV 感染中调节神经元细胞死亡和神经炎症的功能尚不清楚。此前研究发现 JEV/WNV 感染可促进 lncRNA JINR1 表达，且 JINR1 与 RNA 结合基序蛋白 10（RBM10）相互作用，促进病毒复制和神经元凋亡，本研究在此基础上，进一步探究 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 在 JEV/WNV 感染中的作用。

材料和方法

1. 细胞培养、病毒繁殖和感染：使用来自国家细胞科学中心（NCCS）的 SH-SY5Y、Vero 等多种细胞系，Vero 细胞用于繁殖 JEV（GP78 株），C6/36 细胞用于繁殖 WNV（Eg101 株）。
2. 病毒产量的空斑试验分析：在 PS 和 Vero 细胞中分别进行 JEV 和 WNV 的空斑试验，通过细胞接种、感染、培养、固定、染色等步骤，计算病毒滴度（PFU/mL）。
3. 质粒和克隆：将 JEV 和 WNV 的 3'-UTR、NS5 基因组区域，以及 JINR1、DDX5 3'-UTR、GRP78 3'-UTR 等克隆到 pmirGLO 双荧光素酶 miRNA 靶标表达载体中，用于后续实验。
4. 定点突变：使用 Q5 定点突变试剂盒在相关基因片段的 miR-216b-5p/miR-1-3p 结合位点引入突变。
5. RNA 分离和实时定量 PCR：提取 RNA 并进行逆转录和实时定量 PCR，计算基因相对表达量，U6 作为 miRNA 基因的标准化对照。
6. 蛋白质免疫印迹分析：提取蛋白质进行免疫印迹，使用 GRP78、Cleaved PARP、DDX5 等抗体检测蛋白表达水平，并用 ImageJ 软件量化图像。
7. Caspase 3/7 活性检测：使用发光检测试剂盒测定病毒感染细胞中 Caspase 3/7 的酶活性。
8. miRNA 靶标分析：利用 IntaRNA 和 RNAhybrid 预测 miRNA 与病毒基因组的相互作用，通过 miRWalk 和 IntaRNA 数据库确定 miR-216b-5p/miR-1-3p 的 mRNA 靶标。
9. 反义寡核苷酸（ASO）/ 小干扰 RNA（siRNA）转染：将针对 JINR1、RBM10 的 ASO/siRNA，以及 miR-216b-5p/miR-1-3p 的模拟物、抑制剂转染到 SH-SY5Y 细胞中。
10. 双荧光素酶报告基因检测：在 HEK-293T 细胞中进行双荧光素酶报告基因检测，测量荧光素酶活性，以确定 miRNA 与靶基因的相互作用。
11. 染色质免疫沉淀（ChIP）：检测 RNA 聚合酶 II、组蛋白 H3 赖氨酸 4 三甲基化（H3K4me3）、组蛋白 H3 赖氨酸 27 三甲基化（H3K27me3）在 miR-216b-5p/miR-1-3p 启动子区域的结合情况。
12. 紫外线交联 Ago2 RNA 免疫沉淀（UV Ago2 RIP）：评估 miRNA 过表达时，JINR1、GRP78、DDX5 和病毒基因组与 Ago2 的结合情况。
13. 统计分析：实验结果以平均值 ± 标准误（SEM）表示，采用配对学生 t 检验进行组间比较，P < 0.05 为差异具有统计学意义。

研究结果

1. JEV/WNV 感染导致 SH-SY5Y 细胞中 miR-1-3p 和 miR-216b-5p 表达下调：通过生物信息学预测发现 JEV 和 WNV 基因组存在多个 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 结合位点。对感染细胞进行时间依赖性表达分析，发现 JEV/WNV 感染后，成熟 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 转录本水平显著下调，且呈时间依赖性，以 miR-370-5p 为阳性对照，miR-30e-3p 为阴性对照，验证了实验结果的可靠性。
2. JEV/WNV 感染期间 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 下调是由于转录抑制：测量 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 的初级和前体转录本表达，发现它们在 JEV/WNV 感染后也呈时间依赖性下调，表明 miRNA 下调发生在转录阶段。ChIP qRT-PCR 结果显示，JEV/WNV 感染增强了 H3K27me3 在 miR-216b-5p、miR-1-3p 和 miR-370-5p 启动子上的结合，同时减少了 RNA Pol-II 和 H3K4me3 的结合，且 miRNA 加工酶 Drosha、Dicer 和 DGCR8 的 mRNA 表达无显著变化，进一步证实了转录抑制是 miRNA 下调的原因。
3. miR-216b-5p 和 miR-1-3p 通过直接结合病毒基因组抑制 JEV/WNV 复制：过表达 miR-216b-5p 或 miR-1-3p 可使感染 JEV 或 WNV 的 SH-SY5Y 细胞内病毒 RNA 水平显著降低，抑制 miR-216b-5p 或 miR-1-3p 则会增加病毒 RNA 水平，空斑试验也证实了 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 对病毒复制的抑制作用。双荧光素酶报告基因检测和 UV Ago2 RIP 实验表明，miR-216b-5p 和 miR-1-3p 可直接结合 JEV 和 WNV 基因组的 NS5 和 3'-UTR 区域，增强病毒基因组与 Ago2 的结合，促进其降解，从而抑制病毒复制。
4. miR-216b-5p 和 miR-1-3p 过表达减轻 JEV 或 WNV 感染诱导的神经元细胞死亡：过表达 miR-216b-5p 或 miR-1-3p 可显著降低 JEV 或 WNV 感染诱导的 SH-SY5Y 细胞中 Caspase 3/7 活性和 Cleaved PARP 蛋白表达，抑制 miR-216b-5p 或 miR-1-3p 则会增强这些指标，表明 miR-216b-5p 或 miR-1-3p 过表达可减轻病毒诱导的神经元细胞死亡。
5. JINR1 介导 JEV 和 WNV 感染期间 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 的下调：敲低 JINR1 可显著挽救 JEV 或 WNV 感染导致的 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 转录本表达下降，过表达 JINR1 则会降低其表达。ChIP qRT-PCR 结果显示，JINR1 沉默减弱了病毒介导的 H3K27me3 在 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 启动子上的结合增加，阻止了 RNA-Pol-II 和 H3K4me3 结合的减少，表明 JINR1 特异性介导了 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 在 JEV 和 WNV 感染期间的转录抑制。
6. RBM10 调节 JEV/WNV 感染期间 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 的转录抑制：RBM10 沉默可防止 JEV 和 WNV 感染介导的 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 转录本表达下降，过表达 RBM10 则会抑制其表达。RBM10 敲低减少了 H3K27me3 在 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 启动子上的结合，增强了 RNA-Pol-II 和 H3K4me3 的结合，表明 RBM10 也参与了 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 的转录抑制，但 RBM10 对 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 转录抑制的机制尚不清楚。
7. miR-216b-5p 和 miR-1-3p 调节 SH-SY5Y 细胞中 JINR1 的水平：双荧光素酶报告基因检测和 RIP 分析表明，miR-216b-5p 和 miR-1-3p 可与 JINR1 结合，过表达 miR-216b-5p 或 miR-1-3p 可降低 JINR1 表达，抑制 miR-216b-5p 或 miR-1-3p 则会增加 JINR1 表达。
8. JINR1 通过 miR-1-3p/DDX5 轴调节神经元细胞中的 JEV/WNV 复制：通过数据库分析发现 DDX5 是 miR-1-3p 的靶基因，且可调节 JEV 复制。JEV/WNV 感染后，DDX5 转录本和蛋白表达增加。过表达 miR-1-3p 可降低 DDX5 表达，抑制 miR-1-3p 则会增加其表达，双荧光素酶和 UV Ago2 RIP 实验证实了 miR-1-3p 与 DDX5-3'-UTR 的结合。敲低 JINR1 可降低 DDX5 表达，抑制 miR-1-3p 或过表达 DDX5 可部分挽救 JINR1 敲低导致的病毒复制减少，表明 JINR1 通过海绵吸附 miR-1-3p 稳定 DDX5 表达，促进 JEV 和 WNV 复制。
9. JINR1 通过 miR-216b-5p/GRP78 轴促进神经元细胞中的 JEV 和 WNV 复制：发现 GRP78 是 miR-216b-5p 的靶基因，可促进多种病毒复制。过表达 miR-216b-5p 可降低 GRP78 表达，抑制 miR-216b-5p 则会增加其表达，双荧光素酶和 UV Ago2 RIP 实验证实了 miR-216b-5p 与 GRP78-3'-UTR 的结合。敲低 JINR1 可降低 GRP78 表达，抑制 miR-216b-5p 可部分挽救 JINR1 敲低导致的病毒复制减少，表明 JINR1 通过海绵吸附 miR-216b-5p 增强 GRP78 表达，支持病毒复制。

讨论

JEV 和 WNV 感染神经元细胞可导致严重后果，此前研究发现 JINR1 和 RBM10 在 JEV/WNV 感染中发挥重要作用，但 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 及其与 JINR1 的关联在 JEV/WNV 感染中的作用未知。本研究表明，JEV/WNV 感染抑制神经元细胞中 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 的表达，miR-216b-5p 和 miR-1-3p 直接结合病毒基因组，过表达可减少病毒复制和神经元细胞死亡，且在其他病毒感染中也有调节作用。JINR1 和 RBM10 不仅促进 NF-κB 靶基因转录，还参与 miR-216b-5p 和 miR-1-3p 的转录抑制，它们可能组成 RNA - 蛋白质复合物发挥作用，但具体机制有待进一步研究。此外，JINR1 像其他 lncRNA 一样，在转录和转录后水平调节基因表达，通过调控 miR-216b-5p/GRP78 和 miR-1-3p/DDX5 轴，促进病毒感染和神经元细胞死亡，是 JEV/WNV 感染中的关键促病毒因子。