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本文构建了一种新型人血管紧张素转化酶 2（hACE2）基因敲入（KI）小鼠模型 Col1a1-K18-hACE2。该模型感染新冠病毒（SARS-CoV-2 ）B.1 毒株后，能模拟呼吸道疾病症状，且避免了转基因 K18-hACE2 模型的神经病变问题，为研究新冠发病机制和治疗提供新途径。
引言
严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）是 2019 冠状病毒病（COVID-19）的病原体。在 COVID-19 大流行期间，动物模型对于测试新型疫苗、抗病毒药物和其他治疗方法至关重要。SARS-CoV-2 的刺突糖蛋白以血管紧张素转化酶 2（ACE2）为受体进入宿主细胞，但野生型（WT）小鼠的 ACE2（mACE2）不能有效结合 SARS-CoV-2 的刺突糖蛋白，因此 WT 小鼠对感染具有抗性。为了开发易感小鼠模型，人们采用了病毒适应、通过病毒载体和转基因方法引入人 ACE2（hACE2）受体等策略。
K18-hACE2 转基因小鼠和金黄地鼠（GSHs）成为研究 SARS-CoV-2 发病机制的参考动物模型。K18-hACE2 小鼠是通过在人细胞角蛋白 18 基因启动子（KRT18 或 K18）控制下随机插入多个 hACE2 基因副本而创建的，该启动子可实现高水平表达且特异性针对上皮细胞。感染 SARS-CoV-2 的 K18-hACE2 小鼠会出现进行性体重减轻和严重临床症状，常因神经侵袭和广泛脑部感染在感染后 5 - 7 天安乐死，这与人类 COVID-19 的病理不一致。因此，需要开发新的小鼠模型来更好地模拟人类疾病。
敲入（KI）模型通过在特定基因座靶向插入定义数量的基因拷贝，能更准确可预测地表达转基因。本研究利用基于重组酶的方法，将原始 K18-hACE2 转基因插入胶原蛋白 Iα 链（COL1A1）基因座，生成 Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠，并与 K18-hACE2 转基因小鼠模型对比其感染 SARS-CoV-2 B.1（D614G）毒株后的致病性。
结果
- hACE2 在 Col1a1-K18-hACE2 小鼠中的表达评估：通过重组酶介导系统将原始 K18-hACE2 转基因插入 COL1A1 基因座，生成新的 hACE2 KI 小鼠模型。通过逆转录定量 PCR（RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹（WB）分析发现，hACE2 mRNA 和蛋白在 Col1a1-K18-hACE2 小鼠不同组织中的表达具有异质性，与 K18-hACE2 小鼠相比，在胰腺、淋巴结和肌肉中表达较高，在肾脏、大脑和肝脏中表达较低。
- Col1a1-K18-hACE2 小鼠感染 SARS-CoV-2 B.1 后的生存情况：Col1a1-K18-hACE2 小鼠（n = 27）和 K18-hACE2 小鼠（n = 4）经鼻内接种 SARS-CoV-2 B.1（D614G）毒株，未感染的 KI 动物（n = 5）接种磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为对照。感染后 14 天内监测动物体重和临床症状。结果显示，两种模型小鼠在感染后约 3 天开始出现体重减轻，但 K18-hACE2 小鼠出现严重临床症状，如活动减少、呼吸困难和神经症状，全部在 6 - 7 天达到人道终点并安乐死；Col1a1-K18-hACE2 小鼠虽有体重减轻，但未出现严重临床症状，多数动物在感染后 9 天开始体重增加，14 天时体重恢复至初始体重的 90%，表明 B.1 SARS-CoV-2 感染在 Col1a1-K18-hACE2 小鼠中的致病性明显低于 K18-hACE2 转基因小鼠。
- SARS-CoV-2 B.1 在 Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠呼吸道的复制情况：收集感染后不同时间点的口咽拭子、右中叶肺组织和鼻甲样本进行病毒 RNA 分析，结果显示 K18-hACE2 和 Col1a1-K18-hACE2 小鼠在所有提及的组织中均出现广泛感染。Col1a1-K18-hACE2 小鼠口咽拭子和肺组织中的 RNA 水平在 3 dpi 达到峰值，随后逐渐下降；鼻甲中的病毒载量（VLs）在两种模型中相似，14 dpi 时 Col1a1-K18-hACE2 小鼠仍可检测到部分病毒 RNA。通过对右中叶肺组织样本进行病毒滴定，发现病毒滴度在 3 dpi 达到峰值，随后迅速显著下降。
组织病理学分析表明，Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠出现支气管间质性肺炎，病变随时间加重，14 dpi 时多数动物病变为中度，同时伴有淋巴细胞浆细胞浸润增加。免疫组化（IHC）检测 SARS-CoV-2 核蛋白抗原（NP）发现，感染早期（3 dpi）肺组织中 NP 评分最高，随时间下降，14 dpi 时明显清除，但在 8 - 10 dpi 达到人道终点的动物中，仍可在细支气管上皮中检测到轻度至中度的 SARS-CoV-2 抗原染色。
对肺组织中细胞因子和趋化因子水平的分析发现，感染动物的 IL-6、IFNγ、IP-10、MCP-1 和 MIP-1α 水平均高于未感染对照组。Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠中，IP-10 和 IL-6 在 3 dpi 达到峰值，14 dpi 时显著下降；IFNγ、MCP-1 和 MIP1α 在 7 dpi 达到峰值，随后下降，14 dpi 时部分小鼠仍有残留水平，可能与此时的组织病变有关。
4. SARS-CoV-2 B.1 在其他组织中的复制情况：对多种组织样本进行 VLs 定量分析发现，两种模型中大多数组织未检测到病毒，仅在心脏和唾液腺中检测到低水平病毒。K18-hACE2 转基因动物的脑组织中检测到高 VL，而 Col1a1-K18-hACE2 小鼠仅在少数动物的脑组织中检测到低水平 VL，且体重减轻最多、肺 VL 最高的安乐死动物脑组织中未检测到 VL。
5. Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠不会发生大规模脑部感染：对所有动物的脑组织进行纵向病毒学和组织学分析，结果显示，Col1a1-K18-hACE2 小鼠仅在部分动物的 3 dpi 和 7 dpi 检测到低水平 VL，且任何时间点均未检测到感染性病毒；而 K18-hACE2 小鼠在安乐死时（6 - 7 dpi）所有脑组织样本均显示出显著更高的 VL 和高病毒滴度。
组织学分析表明，Col1a1-K18-hACE2 模型在任何分析时间点或达到人道终点的动物脑组织中均未发现病变，IHC 也未检测到 SARS-CoV-2 NP 抗原；而 K18-hACE2 感染动物的脑组织出现病变，且在安乐死时检测到高密度的抗原扩散。
讨论
本研究通过评估 Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠感染 SARS-CoV-2 B.1 D614G 毒株的过程，并与 K18-hACE2 转基因小鼠模型进行直接比较，对该新型小鼠模型进行了表征。主要发现包括该 KI 模型对 SARS-CoV-2 感染的易感性以及因脑部病毒复制和病变减少而降低的致死率。
在 COVID-19 大流行初期，为替代 K18-hACE2 转基因小鼠模型，多个实验室开发了新的 hACE2 小鼠模型。本研究采用将单拷贝转基因插入 COL1A1 基因座但在 K18 启动子控制下的策略，利用重组酶介导的盒式交换（RMCE）插入单拷贝转基因，以更好地模拟生理表达，降低 hACE2 受体的异位表达和改变其组织分布，进而影响致死率。
与 K18-hACE2 转基因小鼠相比，Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠感染 B.1 毒株后临床症状明显减轻，无神经症状，这与 KI 小鼠脑部病毒复制较低一致。在呼吸道中，两种模型均观察到病毒复制，但 Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠在 7 dpi 时的 VL 和抗原检测一般较低，不过此时肺组织病变和炎症在两种模型中相当。
分析不同组织中 hACE2 的表达发现，Col1a1-K18-hACE2 小鼠在 mRNA 和蛋白质水平上，肺和鼻甲中的表达与 K18-hACE2 小鼠相当或更高，而脑和肝中的表达较低，其中脑 hACE2 表达更接近人类生理情况。Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠感染后体重部分恢复，存活率超过 70%，这与其他 hACE2 KI 小鼠模型相似，表明该模型在呼吸道有大量病毒复制，但向肺外器官的传播有限。
在 Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠中，SARS-CoV-2 在呼吸道尤其是肺中大量复制。尽管病毒清除，但 7 dpi 时肺病变与 K18-hACE2 小鼠相似，14 dpi 时仍存在。感染诱导了多种细胞因子的产生，其水平变化与病变和免疫细胞浸润相关。
Col1a1-K18-hACE2 KI 模型与 K18-hACE2 转基因模型的主要区别在于神经侵袭。Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠脑组织中仅检测到残留病毒 RNA，未检测到复制性病毒或病毒蛋白，也无明显脑病变；而 K18-hACE2 转基因小鼠则出现严重的脑部感染和病变。hACE2 在两种模型中的表达差异，尤其是在脑和肺中的不同表达，可能是导致 Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠脑部感染水平较低、神经症状较少，同时呼吸道病理增强的关键因素。不过，神经侵袭不仅取决于 hACE2 受体表达，还与病毒递送途径和剂量有关。
本研究作为新动物模型的初步表征存在一定局限性。实验动物年龄范围为 5 - 11 个月，虽未发现安乐死和康复动物之间的年龄差异，但年龄仍可能影响 SARS-CoV-2 感染的致病性。hACE2 表达仅在组织整体水平进行了 mRNA 和蛋白质分析，还需在特定细胞类型中进一步表征。此外，研究仅针对一种病毒变体和单一剂量进行，未来需对更多变体和剂量进行研究。尽管如此，Col1a1-K18-hACE2 模型在病毒动力学和病理方面与金黄地鼠相似，但具有试剂更易获取、动物设施更易容纳的优势。
目前已有多种评估抗病毒药物和疫苗的小鼠模型，但都无法完全模拟人类疾病的所有方面。Col1a1-K18-hACE2 模型的开发和进一步表征可能克服部分局限性，为研究 COVID-19 的特定方面，如炎症后果、COVID 后综合征（PCC）或后遗症、药物治疗的长期影响以及再感染易感性等提供有价值的工具。
材料和方法
- 敲入模型的创建：利用 RMCE FLP-FRT 系统，将原始 K18-hACE2 转基因插入胶原蛋白 COL1A1 基因座，创建 B6;129S-Col1a1tm1(K18-hACE2)Irb/Irsi（Col1a1-K18-hACE2）小鼠模型。具体步骤包括构建靶向载体、转染 KH2 细胞、筛选阳性克隆、将修饰的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚中，最后将注射后的囊胚移植到受体雌性小鼠体内。
- 生物安全批准和病毒分离：SARS-CoV-2 实验经 Germans Trias i Pujol 研究所（IGTP）生物安全委员会批准，在生物安全 3 级实验室（BSL-3）进行。本研究使用的 B.1 SARS-CoV-2 毒株分离自西班牙住院患者的鼻咽拭子，在 Vero E6 细胞中传代两次后收集上清液，通过 Reed-Muench 方法滴定病毒滴度，并将病毒序列提交至 GISAID 数据库。
- 动物实验和研究设计：实验在 BSL-3 设施内进行，使用 36 只 5 - 11 个月大的成年小鼠，包括 32 只 Col1a1-K18-hACE2 KI 小鼠和 4 只 K18-hACE2 转基因小鼠，所有组均进行性别平衡。感染实验分两次进行，小鼠经异氟烷麻醉后，接种 1000 TCID50的 B.1 毒株或 PBS（对照组）。感染后每天监测体重和临床症状，在感染后 3、7、14 天或达到人道终点时安乐死小鼠，收集组织样本进行分析。人道终点标准包括体重减轻超过初始体重的 20% 和 / 或出现中度至重度临床症状（包括神经症状）。
- 组织采样和处理：收集的组织样本在含有 DMEM 和 1% 青霉素 - 链霉素的溶液中匀浆，离心后取上清液储存于 - 80°C，用于 hACE2 表达和 VL 分析。
- hACE2 mRNA 表达分析：使用 Viral RNA/Pathogen Nucleic Acid Isolation kit 提取组织 RNA，通过 RT-qPCR 检测 hACE2 受体表达，以小鼠 gapdh 基因作为内参，数据以 delta-Ct 值和相对表达量表示。
- ACE2 蛋白表达分析：通过 WB 分析 ACE2 蛋白表达。收集组织样本进行冷冻切片、匀浆、离心，测定总蛋白浓度后进行 SDS-PAGE 电泳，转膜后用特异性抗体进行检测。
- SARS-CoV-2 PCR 检测和病毒载量定量：使用 RT-qPCR 对两组组织（标准组和扩展组）进行无细胞病毒 RNA 定量。RNA 提取后，按照特定的 PCR 反应体系和热循环条件进行扩增，通过标准曲线计算病毒载量，同时检测小鼠 gapdh 基因作为扩增对照。
- 病毒滴定：对肺组织（右中叶）进行病毒滴定，评估复制性病毒的存在。将组织匀浆后进行系列稀释，接种到 Vero E6 细胞单层上，培养 5 天后观察细胞病变效应，通过 Reed-Muench 方法计算 TCID50。
- 组织学和免疫组化分析：在指定终点收集组织样本，部分用于 VL 分析，其余固定在 10% 缓冲福尔马林溶液中。对肺、鼻甲和脑组织进行常规组织学检查，采用半定量方法评估炎症程度；同时使用免疫组化技术检测 SARS-CoV-2 NP 抗原，对病毒抗原含量进行半定量评分。
- 细胞因子定量：通过 Luminex 技术分析肺组织提取物中 IP-10、IL-6、IFNγ、MCP-1 和 MIP-1α 细胞因子水平，以评估病毒诱导的炎症反应。样本经处理后，按照特定试剂盒和软件进行检测和分析。
- 假病毒生成和中和试验：采用基于假病毒的中和试验评估 SARS-CoV-2 B.1 感染后中和抗体的产生。将表达荧光素酶的 HIV 假病毒与热灭活的血清样本孵育，然后加入 HEK293T/hACE2 细胞，48 小时后检测荧光素酶活性，计算 ID50。
- 统计分析：使用 GraphPad Prism 9.0.0 生成图表，使用 R v4.3 进行统计分析。生存曲线采用 Kaplan-Meier 法估计，组间比较使用 log-rank 检验；病毒载量等数据使用 Peto-Peto 左删失样本检验并校正多重比较；组织病理学、免疫组化评分和病毒滴定数据使用独立性渐近广义 Pearson 卡方检验；细胞因子滴度使用 Kruskal-Wallis 检验和 Conover 非参数检验进行比较。
